Biofabrication와 바이오 전자 인터페이스 브리지

1. 알긴산의 전착 악어 클립을 사용하여 패치 코드를 통해 사용자 정의 가공 전극에 전원 공급 장치를 연결합니다. 인듐 주석 산화물 (ITO)는 유리 슬라이드 양극 역할을합니다 (전극 작업) 및 백금 호일은 음극 (반대 전극) 될 것입니다 있었다. 기능화되는 ITO 표면 카운터 전극을 반대하고 해결책이나 증착 솔루션 표면에 포함되는 수평 등으로 담근 것으로 수직 어느 위치하도록 전극을 둡니다. 증류수에 1 %의 알긴산과 0.5 % CaCO 3 (중량으로) 혼합 후 솔루션을 autoclaving하여 알지네이트요 증착 솔루션을 준비합니다. 그것은 지속적으로 사용하지 않는 솔루션을 끓게하는 것이 좋습니다. 증착 용액에 잠수함 두 전극을. 사용 알지네이트요는 fluorescently fluorescen 가능하도록하기 위해서, 같은 쳉 외. 14 당 FluoroSpheres (Invitrogen)으로 표시됩니다결과 필름의 CE 이미징. 2 분 동안 일정한 전류 밀도 (3 / M 2)를 적용, 전압 2-3의 범위 내에서 변경됩니다 V. 전극을 분리하고 비 예금 솔루션을 제거합니다. 부드럽게 불필요한 프로그램 알지네이트요을 제거 NaCl (0.145 M)과 필름을 린스. 젤을 강화하기 위해 CaCl 2 (0.1 M)에서 필름을 간단히 (~ 1 분) 품다. NaCl (0.145 M)와 헹굼 및 CaCl 2 (1 ㎜)로 보완 원하는 솔루션에 품어. 형광 현미경 (그림 1B)를 사용하여 이미지. 2. 알긴산의 의사 소통 세포 인구의 Codeposition LB 미디어 재배 신호 발신자 세포 배양 (W3110 wt E. 대장균), 그리고 신호 수신기 세포 배양 (MDAI2 + pCT6-lsrR – A R + PET-dsRed – 관 R), LB 미디어 재배 + 50 μg / ML kanamycin과 암피실린 각, 하룻밤 사이에 어른이되어야합니다차 1의 광학 밀도 증가 (600 nm의시)에 다시 주사. 사용하기 전에 LB과 0.4-0.6에 수신기 세포 배양의 광학 밀도를 조정합니다. 절반 정도의 농도로 희석 세포로, 1 % 알지네이트요, 0.5 % CaCO 3의 최종 농도로 1:1 비율에 증착 2 %의 알지네이트요의 솔루션과 1퍼센트 CaCO 3, 각각의 세포 배양과 믹스를 준비 culturing 밀도. 잘 polydimethylsiloxane (PDMS) (Sylgard 지침에 따라 작성하고 원하는 크기로 절단) 및 백금 카운터 전극에 의해 포함된 두 ITO 전극과 패턴 유리 슬라이드를 사용하십시오. 지원 절차 1 (알긴산의 전착)에 설명된대로 백금과 전원 공급 장치 하나의 ITO 전극을 연결합니다. 수신기 세포를 포함하는 증착 용액에 전극을 담가. 3 면적 치수가 하나의 전극에 의해 정의됩니다 / M 2의 밀도에 정전류로 전원 공급 장치를 설정하는 대한 deposition은 발생합니다. 알지네이트요 행렬에서 셀 codeposition 수 있도록하기 위해 2 분을 전류를 적용합니다. 1.5 단계에서 설명한대로 필름을 씻어. 두 번째, 인접, ITO 전극에 양극 연결을 전환합니다. 증착 절차 (단계 2.4-2.7)를 반복하되 이번에는 보낸 사람의 세포를 포함하는 솔루션을 소개합니다. 37 하룻밤 codeposited 세포와 칼슘 알지네이트요를 포함하는 2 전극 칩을 품어 ° C 인산에 식염수 (PBS)가 10 % LB 미디어와 1 ㎜ CaCl 2와 함께 보충 버퍼. 후 형광 현미경 (그림 2B)을 사용하여 부화, 이미지. 3. 키토산의 전착 악어 클립을 통해 전극에 전원 공급 장치를 연결합니다. 금이 코팅된 실리콘 칩은 음극 (전극 작업) 역할을하며 백금 호일은 양극 (반대 전극)이 될 것입니다. 금 전극의 표면의 위치를​​ 이렇게 일에서 그것은 카운터 전극을 반대하고 모두 해결하거나 증착 솔루션 표면에 포함된되는 수평 등으로 담근 수 중 수직 위치가 결정됩니다. 물에 키토산 부스러기를 혼합하여 키토산 용액을 준비하고 서서히 M HCL은 메이어 외. 15 일까지 설명된 절차를 수행하십시오 만드는 다당류 (최종 산도 5.6) 해산하기 위해 2를 추가. 완전히 증착을위한 원하는 영역을 잠수함이 잠수, 키토산 용액 (0.8 %)에 전극을 삽입합니다. 키토산로는이 fluorescently 5 레이블 수 (-와-6) – carboxyrhodamine 6G succinimidyl 에스테르 (Invitrogen), 우 외에 따라 8, 형광 현미경에 의한 이미지 전착된 필름에.. 2 분 동안 일정한 전류 밀도 (4 / M 2)를 적용합니다. 전압 2-3의 범위 내에서 이동 V. depositio에 노출된 작업 전극의 금색 표면 영역의 함수로 전류 밀도를 계산합니다N 솔루션입니다. 불필요한 키토산를 제거하는 DI 워터로 전극을 씻어. 칩은 물 또는 PBS (10 MM, 산도 7.0)에 저장할 수 있습니다. 형광 현미경 (그림 3C)를 사용하여 이미지. 4. 기능화 키토산 필름과 전기 화학 형질 도입 4의 전류 밀도 절차 3 (키토산의 전착)에 따라 패턴 전극을 향해 / 평방 미터에서 솔루션 (1 % 키토산, 680 U / ML GOx, 산도 5.6)에서 Codeposit 키토산과 포도당 산화 효소 (GOx). GOx에 속은 키토산 필름이 생성됩니다. 작업 전극, 반대 전극과 자세 / 같은 그림 4A에 설명된 기준 전극과 같은 AgCl와 같은 백금 와이어 등 3 전극 시스템으로 취급 전극을 부착합니다. NaCl (0.1 M)를 포함하는 인산염 완충 용액 (0.1 M, pH를 7.0)에 전극을 담가. Electrochemically 키토산에 단백질을 결합하다chronoamperometry 10을 사용 60에 대해 일정한 전압 (0.9 V)을 적용하여 필름. 인산염 완충액에서 칩 (0.1 M, 산도 7.0) 장소 및 unreacted NaCl과 unconjugated GOx을 제거하는 궤도 흔드는에서 10 분간 씻는다. 5 밀리미터의 포도당 용액으로 단계 4.2 잠그다에 설명된대로 세 전극 시스템에 다시 첨부합니다. 순환의 voltammetry 사용 0.7에 긍정적인 방향으로 잠재력을 청소 V. 스위프에서 본 산화의 크기 (그림 4B)에 대한 비교와 같은 더 포도당 산화 효소를 포함하지 컨트롤 필름을 사용합니다. 포도당 용액에서 전극을 제거하고 인산염 완충액 (0.1 M, pH를 7.0)와 헹굼 후 인산염 완충액 8 ML (0.1 M, pH를 7.0을) 포함한 10 ML의 비커에 전극을 배치. 바이어스 0.6 V까지 GOx-작용 칩은 작동 전극 (그림 4C) 역할을합니다. (각 나누어지는가에 의해 포도당 농도를 증가 버퍼에 포도당의 aliquots 추가4 ㎜). GOx-작용 키토산 필름의 안정 상태 전류 및 포도당 농도 사이의 표준 커브를 생성합니다. 5. 효소 어셈블리를 사용하여 단백질 작용화 PDMS를 잘 내에 포함된 인접 금색과 ITO 전극과 패턴 유리 슬라이드를 사용하십시오. 이전 그림과 같이 키토산을 electrodeposit하기 cathodic 잠재력을 가진 편견은 황금 전극. 피펫으로 다음 DI 워터와 PBS에서 간단히 필름을 씻어. fluorescently "AI-2 Synthase"16 일 (DyLight 라벨 키트를 사용하여) PBS의 + 100 U / ML Tyrosinase 표시된 파란색 3 μm의의 솔루션을 추가합니다. 실온에서 1 H 위해 부화 후 PBS로 필름을 린스. 수신기 세포를 (같은 단계 2.1-2.2로 준비)가 포함된 알지네이트요 증착 솔루션을 codeposit 위해 ITO 전극에 양극 잠재력을 적용합니다. 절차 2 2.3-2.6 (알지네이트요의 세포 인구의 Codeposition) 단계를 수행하십시오. 생성하려면전송 신호 (AI-2) 효소, rinsing 후 필름이 10 % LB 미디어 및 1mM CaCl 2 보충 PBS 500 μm의 S-adenosyl의 호모 시스테인 (SAH)의 솔루션을 추가합니다. 솔루션의 증발을 방지 37에서 하룻밤 부화 전극을 커버 ° C. 이것은 빨간 형광 단백질 (dsRed) 발생하여 수신기 세포 응답을하실 수 있습니다. 인접 전극은 codeposited 수신기 세포 (그림 5B)에 의해 표현 AI-2 Synthase와 붉은 형광의 청색 형광을 캡처하는 필터를 조정하여 형광 현미경으로 몇 군데있을 수 있습니다. 6. 대표 결과 부과되는 전기 신호는 전극 표면과 이러한 자극과 같은 전극 표면에 히드로겔 영화로 입금하는 알긴산과 키토산 등의 다당류의 자기 조립을 유발 근처화된 microenvironments (예, 필드 및 그라디언트)을 만들 수 있습니다. 때문에 t자신의 졸 – 겔 전이는 전극 표면에서 발생하는 필름 전극 패턴 (인물 1B, 3C)를 일치의 지오메 트리와 함께 electroaddressed되어 발생합니다. 이러한 알긴산과 키토산 등 Biocompatible 영화는 생물 학적 구성 요소와 기능화 수있는 표면을 제공합니다. 알지네이트요 사용하여 고유의 세포 집단은 별도의 주소에 codeposited되었습니다. 그들의 electroaddressment 증거는 발신자와 수신기 전지 인구 사이의 상호 작용에 따라 관찰하고 있습니다. 보낸 사람 세포에서 분자 autoinducer-2 (AI-2) diffuses는 dsRed 적색 형광 단백질 (그림 2A)의 표현 그 결과 수신기 세포에 의해 촬영된다. 그림 2B에서는 적색 형광은 수신기가 해결되는 전극에서 관찰된다. 키토산에 존재하는 아민 그룹은 전착뿐만 아니라 작용화에 적합한 표면에 필요한 산도 대응으로 제공하고 있습니다. 우리electrochemically 키토산 필름을 전착된하는 biosensing 효소 포도당 산화 효소 (GOx)를 결합하여 이러한 독특한 성질을 이용. 이 효소는 그때 그때 electrochemically 출력 전류를 생산하는 산화 수있는 과산화수소를 생산하는 효소 반응 (그림 4A)를 통해 포도당을 검출하기위한 기능을 제공합니다. GOx 더 GOx를 포함하지 그 영화들은 반대로 포도당의 존재에 강한 양극 신호를 생성 electrochemically 복합이었다 필름있는 것을 보여주는 이러한 방법으로 화학적 신호는 전기. 그림 4B로 transduced 수 있습니다. 이러한 결과는 GOx은 입금 키토산 필름에 조립 수 있으며, 촉매 활동을 유지 나타냅니다. 또한, 그림 4C는 증가 포도당 농도에 대한 응답으로 생산되는 양극 전류의 단계 증가를 보여줍니다. 그림 4C 또한 현재 표준 곡선은 단계 증가 근처 선형 FAS에서 진행 하는것을 보여준다포도당의 양에 의존 hion 덧붙였다. 이러한 결과는 효소도 키토산 필름으로 활용시 포도당 농도를 증가시키는 그것의 감도를 유지한다는 것을 보여주기. 그것은 이전에 동부 표준시 메이어의 작품에서이 시스템의 특징왔다으로 감지 낮은 한도는 이곳에서 공부되지 않았습니다. 알. 우리는 또한 효소 제어 방식으로 키토산에 대한 정의 펜타-티로신 태그를 포함할 수 있도록 설계 관심있는 효소의 공유 결합 고정을 증명하고있다. 특히,이 과정은 효소 tyrosinase에 의해 매개된다. 그림 5A에서 스키마 (상단), 효소에 의해 묘사된 바와 같이, AI-2 Synthase은 펜타-티로신 태그를 포함합니다. Tyrosinase 다음 covalently 키토산의 아민에 바인딩 O-quinones로 잔류물 '페놀 그룹을 산화, 티로신 태그에 역할을합니다. tyrosinase 조립에 의한 AI-2 Synthase와 키토산 필름 작용화 증거는 그림 5B에서 관찰된다 </stAI-2 Synthase가 fluorescently 파란색으로 분류되었습니다 룽>. AI-2 Synthase가 보낸 세포와 같은 방식으로 기판 S-adenosyl의 호모 시스테인 (SAH)에서 AI-2를 생성하기 때문에 SAH의 앞에서 codeposited 수신 세포로의 근접도 fluorescently dsRed 표현으로 응답할 수신기 세포를 일으키는 (그림 5A (아래)). 리시버 세포의 적색 형광 (그림 5B)은 또 하나의 다른 사람에게 AI-2의 확산으로 인해 주소 사이의 상호 작용을 보여줍니다, 그리고 추가로 효소는 키토산 한번 covalently 바인딩된 활동을 유지하기 위해 움직일 수 있음을 나타냅니다. 1. 알긴산의 전착 그림. 알지네이트요의 전착의 () 원리 : 전극 anodically 편견되면서 물의 전기 분해가 지역화된 낮은 산도를 생성할 때, 그 표면에 발생합니다. 탄산 칼슘 입자가 과잉으로 반응양자 인해 칼슘 양이온을 방출하는 입자들이 녹아 있습니다. 알지네이트요의 고분자 체인의 존재에서 이온이 전극에서 가교 히드로겔을 형성, "eggbox"네트워크에 chelated된다. 전극 증가의 거리로서 알지네이트요는 칼슘 이온의 감소 존재로 인해 용액에 남아있는 큰 경향이있다. (B) L 모양의 패턴 ITO 전극은 electrodeposit의 알지네이트요로 사용되었다. PDMS 잘 그린 fluorescently-라벨 알지네이트요 (1 %)와 CaCO 3 (0.5 %) 증착 솔루션을 포함하는 전극으로 해결되었습니다. 2 분 동안 electrodepositing 후에. 3A / M 2의 전류 밀도에서 electroaddressed 알지네이트요의 히드로겔은 형광 현미경으로 몇 군데했습니다. 그림 2. 세포 인구의 Codeposition. 이 E. 사이 (A) 제도 보여주는 상호 작용 대장균의 변종 : 한 인구가 autoinducer-2를 생산 (AI-2), 신호 전달 분자, 그리고 "AI-2를 보낸 사람. '되나 있습니다 다른 인구는 되나 "AI-2 수신기,"AI-2의 기자이며, 발신자의 확산에 의한 AI-2가 접수되면, 그것은 빨간 형광 단백질은 dsRed 표현합니다. (B) AI-2 발신자 인구 전극 쌍 레드 형광 이미지는 왼쪽 전극에서 알지네이트요 함께 codeposited와 AI-2 수신기 인구는 오른쪽 전극에서 알지네이트요 함께 codeposited. 확대보기에만 AI-2 수신기의 dsRed 표현을 보여줍니다. 그림 3. 키토산의 전착. () 제도는 키토산의 산도 종속 전착을 보여주고 있습니다. cathodically 편견 전극에서 물의 전기 분해는이 지역에서 키토산의 졸 – 겔 전이를 자극화된 높은 산도를 (현미경의 음극 근처의 산도 표시기 염료화된 색깔 변화로 표시)됩니다. (B) 아민은 키토산을 제시 내가 줘t 산도 – 응답 특성. 6.3 (키토산의 pKa)의 산도 위 아민은 그 protonated 용해 형태에서 자사의 불용성 겔 형태로 전환을 촉진, deprotonated있다. (C) 패턴 골드 ​​전극은 electrodeposit 키토산으로 사용되었다. 전원 공급 장치에 cathodically 연결된 전극은, 녹색 키토산 (0.8 %) 증착 솔루션 fluorescently-라벨에 열중했다. 2 분 동안 electrodepositing 후에. 4 / M 2의 전류 밀도에서 electroaddressed 키토산 필름은 형광 현미경으로 몇 군데했습니다. 작용 키토산 필름과 그림 4. 전기 형질 도입. () 도식은 세 전극 시스템의 설정을 보여주고 있습니다. 기능화 키토산 필름은 작업 전극, 기준 전극과 같은 카운터 전극과 자세 / AgCl와 같은 백금 와이어 역할을한다. 회를 통해 포도당 수익금의 전기 화학 형질 도입생산 과산화수소가 작동 전극에서 산화 및 발견되지 수있는 표시 전자 효소와 전기 화학 반응. (B) electrochemically 복합 포도당 산화 효소 (GOx)를 포함하는 키토산 필름과 전극의 순환 voltammagram (CV)는 5 밀리미터 포도당 용액에 강한 양극 신호를 보여줍니다. 더 GOx를 포함하지 필름 컨트롤을 역임하고 동일한 솔루션에서 신호가 표시되지 않습니다. (C) 양극 전류 및 포도당 농도 간의 표준 곡선 근처 선형 관계를 (각각 나누어지는 4 밀리미터로 포도당 농도 증가하며 단계 현명한 방식으로 삽입된 페이지 그래프에서 현재의 진폭을 증가)가 표시됩니다. 5 그림. 효소 어셈블리를 사용하여 단백질 작용화합니다. 티로신 – 태그가를 보여주는 (위) 제도는 "AI-2 Synthase"는 covalently tyrosinase 조립에 의해 키토산 필름에 닿는 곳에되고있다. 티로신 잔류물은 oxid가tyrosinase의 작용에 의해 O-quinones에 ized과 공유 결합을 형성 키토산 필름의 아민 그룹과 반응 수 있습니다. (낮은) AI-2 Synthase는 기판 (SAH)에서 AI-2를 생성, 수신기 전지 dsRed 형광 표현에 의해 생성된 AI-2를보고합니다. (B) 골드에 키토산 필름을 보여주는 형광 이미지는 블루 라벨 AI-2 Synthase와 기능화. Adjacently, AI-2 수신기 전지는 이토에 알지네이트요로 codeposited있다. 잘과 부화에 효소 기판의 추가 후, AI-2 수신기 전지는 dsRed 표현합니다.