Colmare il Bio-Electronic Interface con Biofabrication

1. Alginato elettrodeposizione Collegare un alimentatore agli elettrodi abitudine fabbricata tramite patch cord con morsetti a coccodrillo. Un ossido di indio e stagno (ITO), di cui vetrino fungerà da anodo (elettrodo di lavoro) e foglio di platino fungerà da catodo (contro-elettrodo). Posizionare gli elettrodi in modo che la superficie ITO da funzionalizzare oppone il controelettrodo ed è posizionato verticalmente per essere immerso in una soluzione o orizzontalmente in modo tale che la soluzione è contenuta deposizione sulla superficie. Preparare una soluzione di alginato di deposizione mescolando 1% e 0,5% alginato CaCO 3 (in peso) in acqua distillata e poi la soluzione in autoclave. Si raccomanda di agitare continuamente la soluzione quando non in uso. Immergere entrambi gli elettrodi nella soluzione di deposizione. L'alginato usato può essere marcato in modo fluorescente con fluorosfere (Invitrogen), come da Cheng et al. 14, per consentire FLUORESCENTEce l'imaging del film risultante. Applicare una densità di corrente costante (3 A / m 2) per 2 minuti; tensione sposterà nell'intervallo di 2-3 V. Scollegare l'elettrodo e rimuovere la soluzione non depositato. Lavare delicatamente il film con NaCl (0,145 M) per rimuovere alginato superfluo. Incubare brevemente il film (~ 1 min) in CaCl 2 (0,1 M) per rafforzare il gel. Risciacquare con NaCl (0,145 M) e incubare in una soluzione desiderata supplementato con CaCl 2 (1 mM). Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza (figura 1B). 2. Codeposition di popolazioni di cellule comunicanti in alginato Un segnale-mittente coltura cellulare (W3110 peso di E. coli), cresciute in un mezzo LB, e un segnale-ricevitore coltura cellulare (MDAI2 + pCT6-lsrR – amp r + pET-DsRed – kan r), cresciute in un mezzo LB + 50 pg / ml ciascuno di kanamicina e ampicillina, devono essere cresciuto uno nottend re-inoculato per la crescita ad una densità ottica (a 600 nm) di 1. Regolare la densità ottica della coltura cellulare ricevitore a 0,4-0,6 con LB prima dell'uso. Preparare una soluzione di deposizione del 2% e 1% alginato CaCO 3, e mescolate con ogni coltura cellulare in un rapporto 1:1 a una concentrazione finale di 1% alginato, 0,5% CaCO 3, con le cellule diluite ad una densità di circa la metà la coltura densità. Utilizzare un vetrino modellato con due elettrodi di ITO contenuti in un polidimetilsilossano (PDMS) e (preparata secondo le istruzioni Sylgard e tagliato a misura desiderata) e un contro elettrodo di platino. Collegare un elettrodo di ITO ad un alimentatore con il platino come descritto nella Procedura 1 (elettrodeposizione alginato). Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente le cellule deposizione ricevitore. Impostare l'alimentazione di una corrente costante ad una densità di 3 A / m 2, dove è definita la dimensione di superficie dal singolo elettrodo sulla quale deposition si verificherà. Applicare la corrente per 2 minuti per consentire codeposition delle celle della matrice di alginato. Risciacquare il film come descritto nella Fase 1,5. Passare il collegamento anodico al secondo, adiacente, elettrodo ITO. Ripetere la procedura di deposizione (Fasi 2,4 – 2,7), ma questa volta introduce la soluzione contenente le cellule mittente. Incubare la 2-elettrodo chip contenente cellule codeposited e calcio-alginato notte a 37 ° C in salina tamponata con fosfato (PBS) supplementato con mezzi LB 10% e 1 mM CaCl 2. Dopo incubazione, l'immagine usando un microscopio a fluorescenza (Figura 2B). 3. Chitosano elettrodeposizione Collegare l'alimentatore agli elettrodi attraverso coccodrilli. Un chip di silicio rivestito in oro fungerà da catodo (elettrodo di lavoro) e un foglio di platino fungerà da anodo (contro-elettrodo). Posizionare superficie dell'elettrodo d'oro in modo tha si oppone il controelettrodo ed entrambi sono posizionati verticalmente per essere immerso in una soluzione o orizzontalmente in modo tale che la soluzione è contenuta deposizione sulla superficie. Preparare una soluzione di chitosano mescolando fiocchi chitosano in acqua e aggiungendo lentamente 2 M HCl per sciogliere i polisaccaridi (finale pH 5.6), avendo cura di seguire la procedura descritta da Meyer et al. 15. Posizionare gli elettrodi in una soluzione di chitosano (0,8%), sommergendo completamente la zona desiderata per la deposizione. Il chitosano usato può essere marcato in modo fluorescente con 5 – (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimmidil estere (Invitrogen), come da Wu et al 8, il film di immagine elettrodepositata mediante microscopia a fluorescenza.. Applicare una densità di corrente costante (4 A / m 2) per 2 minuti. Tensione sposterà nell'intervallo di 2-3 V. Calcolare la densità di corrente in funzione della superficie d'oro dell'elettrodo di lavoro esposto al Deposition soluzione. Risciacquare l'elettrodo con acqua deionizzata per rimuovere superfluo chitosano. Il chip può essere conservato in acqua o PBS (10 mM, pH 7,0). Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 3C). 4. Trasduzione elettrochimica con un film funzionalizzato Chitosan Codeposit chitosano e glucosio ossidasi (GOX) da una soluzione (1% di chitosano, 680 U / mL GOX, pH 5,6) ad una densità di corrente di 4 A / m 2 su un elettrodo modellato secondo la procedura 3 (elettrodeposizione Chitosan). Un film chitosano intrappolata in GOX verrà generato. Attaccare l'elettrodo trattati per un sistema a tre elettrodi come elettrodo di lavoro, un filo di platino come contro-elettrodo e Ag / AgCl come elettrodo di riferimento, come descritto in Figura 4A. Immergere gli elettrodi in una soluzione tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenente NaCl (0,1 M). Elettrochimicamente la proteina coniugato al chitosanopellicola applicando una tensione costante (0,9 V) per 60 s utilizzando chronoamperometry 10. Posizionare il chip in tampone fosfato (0,1 M, pH 7.0) e lavare per 10 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere qualsiasi GOX NaCl non ha reagito e non coniugata. Ricollegare il sistema a tre elettrodi come descritto al punto 4.2 e immerso in una soluzione di glucosio al 5 mM. Utilizzando voltammetria ciclica, spazzare il potenziale in una direzione positiva a 0,7 V. utilizzare un film di controllo non contenente glucosio ossidasi come confronto per la quantità di ossidazione visto nella scansione (Figura 4B). Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di glucosio e lavare con tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) quindi posizionare gli elettrodi in un becher da 10 mL contenente 8 ml di tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0). Bias il GOX-funzionalizzato chip a 0,6 V per servire come elettrodo di lavoro (Figura 4C). Aggiungere aliquote di glucosio nel buffer (ciascuna aliquota aumenta la concentrazione di glucosio da parte4 mM). Generare una curva standard tra l'attuale stato stazionario e la concentrazione di glucosio per il GOX pellicola chitosano funzionalizzato. 5. Protein Funzionalizzazione Utilizzo Assemblea enzimatico Utilizzare un vetrino modellato con un elettrodo d'oro adiacente e ITO contenuta in un pozzo PDMS. Bias l'elettrodo d'oro con un potenziale catodico per electrodeposit chitosano come illustrato in precedenza. Sciacquare pellicola brevemente in acqua deionizzata e poi PBS con pipetta. Aggiungere una soluzione di 3 pM fluorescente blu "AI-2 Synthase" 16 (usando un kit DyLight etichettatura) + 100 U / mL tirosinasi in PBS. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, quindi risciacquare il film con PBS. Applicare un potenziale anodico per l'elettrodo di ITO codeposit una soluzione di deposizione di alginato contenente cellule ricevitore (come preparati nei passaggi 2.1-2.2). Seguire i passaggi della procedura 2,3-2,6 2 (Codeposition di popolazioni di cellule in alginato). Per generareil segnale trasmesso (AI-2) enzimaticamente, dopo il risciacquo dei film aggiungere una soluzione di 500 pM S-adenosil omocisteina (SAH) in PBS, LB supplementato con mezzi 10% e 1 mM CaCl 2. Coprire gli elettrodi per evitare l'evaporazione della soluzione ed incubare durante la notte a 37 ° C. Ciò consentirà una risposta cellulare ricevitore generando una proteina fluorescente rossa (DsRed). Elettrodi adiacenti possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza regolando i filtri per catturare la fluorescenza blu del AI-2 Synthase e fluorescenza rossa espressa dalle cellule codeposited ricevitore (Figura 5B). 6. Risultati rappresentativi Imposti segnali elettrici possono creare microambienti localizzate (ad esempio, campi e gradienti) vicino a una superficie dell'elettrodo e tali stimoli possono innescare l'auto-assemblaggio di polisaccaridi come alginato e chitosano per depositare una pellicola idrogel sulla superficie dell'elettrodo. Dato che tla transizione sol-gel si verifica sulla superficie dell'elettrodo, la pellicola risultante è electroaddressed, con la sua geometria corrispondente al modello di elettrodo (figure 1B, 3C). Film biocompatibile come alginato e chitosano fornire superfici che possono essere funzionalizzati con componenti biologici. Utilizzando alginato, le popolazioni di cellule uniche sono state codeposited a separare gli indirizzi. Prove di loro electroaddressment è osservato dopo interazione tra il mittente e il ricevitore popolazione di cellule. La molecola autoinducer-2 (AI-2) diffonde dalle cellule del mittente e viene assorbito dalle cellule del ricevitore, con conseguente espressione della proteina fluorescente rossa DsRed (Figura 2A). In Figura 2B, fluorescenza rossa è stata osservata solo in corrispondenza dell'elettrodo sono indirizzate ricevitori. I gruppi amminici presenti sul chitosano fornendo la capacità di risposta pH richiesto per elettrodeposizione così come una superficie adatta per la funzionalizzazione. Noiutilizzato queste caratteristiche uniche dal elettrochimicamente coniugando la biosensori enzima glucosio ossidasi (GOX) per elettrodepositata chitosano film. Questo enzima fornisce quindi la possibilità per il rilevamento di glucosio mediante una reazione enzimatica (Figura 4A) producendo perossido di idrogeno che può quindi essere ossidato elettrochimicamente per produrre una corrente di uscita. In questo modo, un segnale chimico può essere trasdotta in Figura elettrica. 4B mostra che i film in cui GOX è elettrochimicamente coniugato produrre un segnale forte anodico in presenza di glucosio rispetto a quelle pellicole non contenenti GOX. Questi risultati indicano GOX può essere montato su una pellicola depositata chitosano e mantiene l'attività catalitica. Inoltre, la figura 4C mostra un passo-aumento di corrente anodica prodotta in risposta a concentrazioni crescenti di glucosio. La curva standard presenti anche nella figura 4C mostra che il passo di aumenti proceduto in una fas quasi linearehion dipende dalla quantità di glucosio aggiunto. Questi risultati mostrano che l'enzima conserva anche la sua sensibilità alle concentrazioni crescenti di glucosio sulla coniugazione al film chitosano. Il limite inferiore di rilevamento non è stato studiato qui come è stato precedentemente caratterizzati per questo sistema nel lavoro di Meyer et. al. Abbiamo anche dimostrato l'immobilizzazione covalente di un enzima di interesse, progettato per contenere un costume penta-tirosina tag, di chitosano enzimaticamente in un modo controllato. In particolare, questo processo è mediato da tirosinasi. Come si vede dallo schema in figura 5A (superiore), un enzima, AI-2 Synthase include un penta-tirosina tag. Tirosinasi agisce sul tag tirosina, ossidando i gruppi fenolici dei residui »di O-chinoni, che poi si legano in modo covalente alle ammine del chitosano. Prove di funzionalizzazione del film chitosano con l'AI-2 Synthase dalla tirosinasi gruppo si osserva nella figura 5B </strong>, dove l'AI-2 Synthase è stato marcato in modo fluorescente blu. Poiché AI-2 Synthase genera AI-2 dal substrato omocisteina S-adenosil (SAH) nello stesso modo delle celle mittente, la vicinanza di cellule ricevitore codeposited in presenza di SAH causa anche le cellule ricevitore a rispondere fluorescente esprimendo DsRed (figura 5A (inferiore)). Fluorescenza rossa delle cellule ricevitore (Figura 5B) dimostra nuovamente l'interazione tra gli indirizzi a causa della diffusione di AI-2 da uno all'altro, e indica inoltre che gli enzimi immobilizzati per mantenere chitosano attività una volta legata in modo covalente. Figura 1. Elettrodeposizione alginato. (A) Meccanismo di elettrodeposizione alginato: Come un elettrodo è anodicamente polarizzato, l'elettrolisi dell'acqua avviene alla sua superficie, generando un pH basso localizzato. Particelle di carbonato di calcio reagisce con l'avanzodi protoni, rilasciando cationi di calcio come particelle sciogliere. In presenza di catene polimeriche alginato, gli ioni diventano chelati in una rete "Eggbox", formando un idrogel reticolato all'elettrodo. Poiché la distanza aumenta elettrodi, alginato ha una maggiore tendenza a rimanere in soluzione a causa della ridotta presenza di ioni calcio. (B) Una forma di L modellato elettrodo ITO è stata utilizzata per alginato electrodeposit. Un PDMS pozzo è stato fissato l'elettrodo per contenere un alginato verde fluorescente-marcato (1%) e CaCO 3 (0,5%) soluzione di deposizione. Dopo elettrodeposizione per 2 min. ad una densità di corrente di 3A / m 2, l'idrogel è stato ripreso electroaddressed alginato mediante microscopia a fluorescenza. Figura 2. Codeposition di popolazioni cellulari. (A) schema che mostra l'interazione tra due E. ceppi di E.: Una popolazione produce autoinducer-2 (AI-2), Una molecola di segnalazione, e viene chiamato "AI-2 mittente." L'altra popolazione, denominato "AI-2 ricevitore," è un reporter di AI-2, al ricevimento della AI-2 per diffusione da parte del mittente, che esprime la proteina fluorescente rossa DsRed. (B) l'immagine di fluorescenza rossa coppia di elettrodi con la popolazione AI-2 mittente codeposited con alginato sull'elettrodo sinistra e AI-2 popolazione ricevitore codeposited con alginato sull'elettrodo di destra. Visualizzazione ingrandita dimostra l'espressione DsRed dei soli AI-2 ricevitori. Figura 3. Elettrodeposizione Chitosan. (A) schema che mostra il pH-dipendente elettrodeposizione di chitosano. Elettrolisi dell'acqua in un elettrodo polarizzato catodicamente provoca un pH elevato localizzato (indicato da un cambiamento di colore localizzata di un colorante indicatore di pH vicino al catodo in micrografia) che stimola la transizione sol-gel di chitosano in questa regione. (B) Le ammine presenti sul chitosano dòt pH-sensibili proprietà. Sopra un pH di 6,3 (pKa di chitosano) le ammine sono deprotonato, facilitare la transizione dalla sua forma protonata solubile alla sua forma di gel insolubile. (C) Un elettrodo d'oro modellato è stato utilizzato per electrodeposit chitosano. L'elettrodo, catodicamente collegato alla rete di alimentazione, è stato immerso in una verde fluorescente-marcato chitosano (0,8%) soluzione di deposizione. Dopo elettrodeposizione per 2 min. ad una densità di corrente di 4 A / m 2, il film electroaddressed chitosano è stato ripreso mediante microscopia a fluorescenza. Figura 4. Trasduzione elettrochimica con un film chitosano funzionalizzato. (A) schematico che mostra la configurazione di un sistema a tre elettrodi. Chitosano funzionalizzato pellicola funge da elettrodo di lavoro, un filo di platino come contro-elettrodo e Ag / AgCl come elettrodo di riferimento. Trasduzione elettrochimica dei proventi di glucosio attraverso °elettroniche reazioni enzimatiche e elettrochimica mostrati in cui perossido di idrogeno prodotto possono essere ossidati e rilevati in corrispondenza dell'elettrodo di lavoro. (B) ciclico voltammagram (CV) ad elettrodo con una pellicola di chitosano contenente glucosio ossidasi elettrochimicamente coniugato (GOX) mostra un segnale forte anodica in una soluzione di glucosio 5 mM. Un film non contenente GOX servito come controllo e non mostrava alcun segnale nella stessa soluzione. (C) Una curva standard tra corrente anodica e la concentrazione di glucosio che presenta un rapporto quasi lineare (ciascuna aliquota aumentato la concentrazione di glucosio da 4 mM e aumentato anche l'ampiezza della corrente nel grafico inserto in un modo graduale). Figura 5. Funzionalizzazione proteina usando montaggio enzimatica. (A, superiore) schema che mostra tirosina-tag "AI-2 Synthase" essere covalentemente legato a un film di chitosano dall'assemblea tirosinasi. I residui di tirosina diventano ossidoized a O-chinoni dall'azione tirosinasi e possono reagire con i gruppi amminici sulla pellicola chitosano, formando un legame covalente. (A, inferiore) L'IA-2 Synthase genera AI-2 da un substrato (SAH), le cellule del ricevitore segnalare il generata AI-2 da DsRed espressione di fluorescenza. (B) immagini a fluorescenza che mostrano un film di chitosano su oro, funzionalizzati con blu-marcato AI-2 sintasi. Adiacenti, IA-2 cellule ricevitore sono codeposited con alginato su Ito. Dopo aggiunta del substrato enzimatico al pozzo e l'incubazione, le cellule AI-2 ricevitore esprimono DsRed.