Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

1. Alginat Elektrodeposition Schließen Sie eine Stromversorgung zu den individuell gefertigte Elektroden über Patchkabel mit Krokodilklemmen. Ein mit Indium-Zinn-Oxid (ITO) abgedeckt Objektträger wird als Anode wirken (Arbeitselektrode) und Platinfolie wird als Kathode (Gegenelektrode) dienen. Positionieren der Elektroden, so dass die ITO-Oberfläche funktionalisiert werden gegen die Gegenelektrode und entweder vertikal positioniert ist, um in eine Lösung oder horizontal, so daß die Abscheidung auf die Oberfläche enthalten eingetaucht werden. Planen ein Alginat Abscheidungslösung durch Mischen von 1% Alginat und 0,5% CaCO 3 (nach Gewicht) in destilliertem Wasser und dann die Lösung Autoklavieren. Es wird empfohlen, ständig rühren die Lösung, wenn nicht in Gebrauch ist. Tauchen beide Elektroden in der Abscheidungslösung. Das Alginat verwendet werden kann fluoreszierend mit FluoroSpheres (Invitrogen) tragen, nach Cheng et al. 14, um zu ermöglichen Fluoresce Abbildung des resultierenden Films. Tragen Sie eine konstante Stromdichte (3 A / m 2) für 2 Minuten; Spannung wird im Bereich von 2-3 verschieben V. Trennen Sie die Elektrode und entfernen Sie die Nicht-Lösung hinterlegt. Vorsichtig spülen Sie den Film mit NaCl (0,145 M) für überflüssig Alginat zu entfernen. Inkubieren Sie den Film kurz (~ 1 min) in CaCl 2 (0,1 M), um das Gel zu stärken. Spülen Sie mit NaCl (0,145 M) und Inkubation in einer gewünschten Lösung mit CaCl 2 (1 mM) ergänzt. Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop (1B). 2. Mitabscheidung Kommunikation Zellpopulationen in Alginat Ein Signal-Sender Zellkultur (W3110 Gew. E. coli), in LB-Medium gewachsen, und ein Signal-Empfänger Zellkultur (MDAI2 + pCT6-LSRR – amp r + pET-DsRed – kan r), in LB-Medium gezüchtet + 50 pg / mL jeweils Kanamycin und Ampicillin, müssen über Nacht ein angebaut werdenRunde für Wachstum auf eine optische Dichte (bei 600 nm) von 1 geimpft. Stellen optische Dichte des Empfängers Zellkultur 0,4-0,6 mit LB vor der Verwendung. Vorbereiten einer Abscheidung Lösung von 2% Alginat und 1% CaCO 3 und mischen sich Zellkultur in einem Verhältnis von 1:1 bis zu einer Endkonzentration von 1% Alginat, 0,5% CaCO 3, wobei die Zellen verdünnt auf eine Dichte von etwa der Hälfte das Kultivieren Dichte. Mit einem Glas-Objektträger mit zwei ITO-Elektroden durch eine Polydimethylsiloxan (PDMS) und (hergestellt nach Anspruch Sylgard Anweisungen und auf die gewünschte Größe geschnitten) und einer Platin-Gegenelektrode enthalten strukturiert. Schließen Sie das eine ITO-Elektrode an eine Stromversorgung mit dem Platin-wie in Verfahren 1 (Alginat Elektroabscheidung) beschrieben. Die Elektroden in einer Lösung, die die Abscheidung Empfängerzellen. Stellen Sie die Stromversorgung auf einen konstanten Strom bei einer Dichte von 3 A / m 2, wobei die Oberfläche Dimension der einzelnen Elektrode definiert ist, auf dem Deposition auftreten wird. Anwenden des aktuellen für 2 Minuten, um Co-Abscheidung der Zellen in der Alginat-Matrix zu ermöglichen. Spülen der Folie wie in Schritt 1.5 beschrieben. Schalten der anodischen Verbindung mit dem zweiten, benachbarten, ITO-Elektrode. Wiederholen Sie den Vorgang Deposition (Schritte von 2,4 bis 2,7), aber dieses Mal die Einführung der Lösung, welche die Absender-Zellen. Inkubieren Sie die 2-Elektroden-Chip mit abgeschieden Zellen und Calcium-Alginat über Nacht bei 37 ° C in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 10% LB-Medium und 1 mM CaCl 2 ergänzt. Nach der Inkubation Bildes unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskop (2B). 3. Chitosan Elektrodeposition Schließen Sie das Netzteil an den Elektroden über Krokodilklemmen. Eine Gold-beschichteten Silizium-Chip wird als Kathode (Arbeitselektrode) zu handeln und eine Platin-Folie wird als Anode (Gegenelektrode) dienen. Positionieren der Goldelektrode die Oberfläche so thbei er sich gegen die Gegenelektrode und beide entweder vertikal in eine Lösung oder horizontal, so dass die Abscheidungslösung auf der Oberfläche enthalten ist getaucht positioniert werden. Bereiten Sie eine Chitosan-Lösung durch Mischen von Chitosan Flocken in Wasser und langsame Zugabe von 2 M HCl zu den Polysacchariden (End-pH 5,6) lösen und sicherstellen, das Verfahren von Meyer et al. 15 zu befolgen. Platzieren Sie die Elektroden in eine Chitosan-Lösung (0,8%), Notlaufeigenschaften den gewünschten Bereich für die Abscheidung. Das Chitosan verwendet werden können fluoreszierend markiert werden mit 5 – (und-6)-Carboxyrhodamin 6G-succinimidylester (Invitrogen), nach Wu et al 8, ein Bild des elektrisch abgeschiedenen Films durch Fluoreszenzmikroskopie.. Anwenden einer konstanten Stromdichte (4 A / m 2) für 2 Minuten. Die Spannung wird im Bereich von 2-3 zu verschieben V. Berechnen der Stromdichte als Funktion der Goldoberfläche der Arbeitselektrode Elektrode tritt in den Deposition Lösung. Spülen Sie die Elektrode mit VE-Wasser für überflüssig Chitosan zu entfernen. Der Chip kann in Wasser oder PBS (10 mM, pH 7,0) gespeichert werden. Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop (3C). 4. Elektrochemische Transduktion mit einem funktionalisierten Chitosanfolie Codeposit Chitosan und Glucose-Oxidase (GOx) aus einer Lösung (1% Chitosan, 680 U / ml GOx, pH 5,6) bei einer Stromdichte von 4 A / m 2 auf einer strukturierten Elektrode nach der Prozedur 3 (Chitosan Elektrotauchlackier). Ein Film in Chitosan GOx eingeschlossen erzeugt. Befestigen des behandelten Elektrode mit einem Drei-Elektroden-System nach der Arbeitselektrode, einen Platindraht als Gegenelektrode und eine Ag / AgCl als Referenzelektrode, wie in 4A beschrieben. Tauchen der Elektroden in einer Phosphat-Pufferlösung (0,1 M, pH 7,0), NaCl (0,1 M). Elektrochemisch Konjugat des Proteins an den ChitosanFilm durch Anlegen einer konstanten Spannung (0,9 V) für 60 mit Chronoamperometrie 10. Platzieren Sie den Chip in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) waschen und für 10 Minuten auf einem Schüttler, um nicht umgesetztes NaCl und unkonjugiertes GOx entfernen. Der Drei-Elektroden-System wieder befestigen, wie in Schritt 4.2 und Tauchen in eine Lösung von 5 mM Glucose beschrieben. Mit Cyclovoltammetrie, fegen das Potenzial in eine positive Richtung zu 0,7 V. Verwenden Sie eine Kontrolle, die kein Film Glucose-Oxidase als Vergleich für die Höhe der Oxidation in der Sweep gesehen (Abbildung 4B). Die Elektroden aus der Glukose-Lösung und Spülen mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), dann stellen die Elektroden in einen 10-ml-Becherglas mit 8 ml Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0). Bias des GOX-funktionalisierten Chip bis 0,6 V als Arbeitselektrode (4C) dienen. In Aliquots von Glucose zu dem Puffer (jedes Aliquot erhöht die Glucosekonzentration durch4 mM). Generieren einer Standardkurve zwischen dem stationären Strom und der Glukose-Konzentration für die GOx-funktionalisierten Chitosanfilm. 5. Protein-Funktionalisierung mit Enzymatische Vollversammlung Verwenden Sie einen Objektträger aus Glas mit einem benachbarten Gold-und ITO-Elektrode innerhalb eines PDMS gut enthielt gemustert. Bias der Goldelektrode mit einem kathodischen Potential, Chitosan elektrochemisch wie zuvor gezeigt. Spülen Film kurz in DI-Wasser und dann mit einer Pipette PBS. Eine Lösung von 3 &mgr; M blau fluoreszierend markierten "AI-2-Synthase" 16 (mit einem DyLight Labeling Kit) + 100 U / ml Tyrosinase in PBS. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur, dann spülen Sie den Film mit PBS. Anwenden einer anodischen Potential der ITO-Elektrode, um eine Lösung mit Alginat-Deposition-Empfänger-Zellen (wie in den Schritten von 2,1 bis 2,2) hergestellten codeposit. Folgen Sie den Schritten von 2,3 bis 2,6 der Geschäftsordnung 2 (Mitabscheidung Zellpopulationen in Alginat). So generierendas übertragene Signal (AI-2) enzymatisch nach dem Spülen die Filme eine Lösung von 500 pM S-Adenosyl-Homocystein (SAH) in PBS mit 10% LB-Medium und 1 mM CaCl 2 ergänzt. Decken Sie die Elektroden, um die Verdampfung der Lösung zu verhindern und über Nacht bei 37 ° C Dies wird für einen Empfänger Zell-Antwort durch Erzeugen eines rot fluoreszierendes Protein (DsRed) zu ermöglichen. Aneinander angrenzende Elektroden können mit Fluoreszenzmikroskopie durch Anpassung der Filter können Sie die blaue Fluoreszenz der AI-2-Synthase und rote Fluoreszenz von den Zellen abgeschieden Empfänger (Abbildung 5B) zum Ausdruck zu erfassen abgebildet werden. 6. Repräsentative Ergebnisse Auferlegt elektrischen Signale können lokalisierten Mikroumgebungen (z. B. Felder und Gradienten) in der Nähe einer Elektrodenoberfläche und diese Stimuli können die Selbstorganisation der Polysaccharide wie Alginat und Chitosan als Hydrogel-Film auf der Elektrode abzuscheiden auszulösen. Weil tseine Sol-Gel-Übergang an der Elektrodenoberfläche, der resultierende Film wird electroaddressed, mit entsprechenden Geometrie der Elektrodenstruktur (1B, 3C). Biokompatible Filmen wie Alginat und Chitosan bereitzustellen Oberflächen, die mit biologischen Komponenten zu funktionalisieren. Durch Verwendung von Alginat, haben einzigartige Zellpopulationen an getrennten Adressen wurden abgeschieden. Beweise für ihre electroaddressment basiert auf der Interaktion zwischen Sender und Empfänger-Zell-Population beobachtet. Das Molekül Autoinduktions-2 (AI-2) diffundiert aus den Sender-Zellen und wird von den Zellen aufgenommen Empfänger, was zur Expression des dsRed rot fluoreszierendes Protein (2A). In 2B ist rote Fluoreszenz nur auf der Elektrode, wo Empfänger gerichtet beobachtet. Die Amin-Gruppen an Chitosan das sie in die pH-Ansprechverhalten für die elektrolytische Abscheidung sowie eine geeignete Oberfläche für eine Funktionalisierung erforderlich. Wirausgenutzt Diese einzigartigen Eigenschaften von elektrochemisch Konjugation des Biosensor-Enzym Glucose-Oxidase (GOx), um galvanisch Chitosanfilme. Dieses Enzym liefert dann die Fähigkeit zum Nachweis von Glukose durch eine enzymatische Reaktion (4A) Herstellung von Wasserstoffperoxid, die dann elektrochemisch oxidiert werden kann erzeugen einen Ausgangsstrom. Auf diese Weise kann ein chemisches Signal in elektrische. 4B zeigt, dass transduziert werden Filme, in denen GOx elektrochemisch konjugierten erzeugen ein starkes Signal anodischen in Gegenwart von Glucose, um die Filme, die keine GOx gegenüberliegenden war. Diese Ergebnisse zeigen, GOx auf einen abgeschiedenen Film Chitosan zusammengesetzt werden kann und die katalytische Aktivität beibehalten. Darüber hinaus zeigt 4C ein Schritt-Anstieg im anodischen Strom in Reaktion auf zunehmenden Glucosekonzentrationen hergestellt. Die Standardkurve auch in 4C zeigt, dass die Schritt-Erhöhungen in einer nahezu linearen fas ginghion abhängig von der Menge an Glucose zugegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Enzym behält auch seine Empfindlichkeit zu erhöhen Glucosekonzentrationen nach Konjugation mit dem Chitosan-Film. Die untere Nachweisgrenze wurde hier nicht, wie es zuvor für dieses System in der Arbeit von Meyer et gekennzeichnet untersucht. al. Wir haben auch die kovalente Immobilisierung eines Enzyms von Interesse, entwickelt, um eine individuelle Penta-Tyrosin-Tag, zu Chitosan in einer enzymatisch gesteuert enthalten gezeigt. Insbesondere wird dieses Verfahren durch das Enzym Tyrosinase vermittelt. Wie durch die Regelung in 5A (obere), ein Enzym dargestellt, umfasst AI-2-Synthase ein Penta-Tyrosin-Tag. Tyrosinase wirkt auf die Tyrosin-Tag, Oxidieren der Rückstände "Phenolgruppen zu o-Chinonen, die dann kovalent an das Chitosan Amine binden. Der Nachweis von Chitosan Film Funktionalisierung mit dem AI-2-Synthase durch Tyrosinase Montage ist in 5B beobachtet </strong>, wo die AI-2-Synthase wurde fluoreszierend markiert wurde blau. Da AI-2-Synthase erzeugt AI-2 von dem Substrat S-Adenosyl-Homocystein (SAH) in der gleichen Weise wie die Sender Zellen, die Nähe zu abgeschieden Empfänger-Zellen in Gegenwart von SAH auch bewirkt, dass die Empfänger Zellen Fluoreszenz durch Expression dsRed reagieren (5A (niedriger)). Rot-Fluoreszenz der Empfänger-Zellen (5B) zeigt erneut Wechselwirkung zwischen Adressen aufgrund der Diffusion von AI-2 von einem zum anderen und gibt des Weiteren, dass die Enzyme zu Chitosan erhalten Aktivität einmal kovalent gebunden immobilisiert. Abbildung 1. Alginat Elektroabscheidung. (A) Mechanismus der Elektrotauchlackier Alginat: Als anodisch vorgespannt wird, tritt Wasserelektrolyse an seiner Oberfläche, Erzeugen eines lokalisierten niedrigen pH-Wert. Calciumcarbonat-Teilchen reagieren mit dem Überschussvon Protonen, der Freisetzung von Kalzium-Kationen als die Partikel zu lösen. In Gegenwart von Alginat Polymerketten werden die Ionen in einer "Eierkarton" Netzwerk chelatisierte Bildung eines vernetzten Hydrogels an der Elektrode. Da die Entfernung von der Elektrode zu, weist eine größere Tendenz Alginat in der Lösung aufgrund der reduzierten Gegenwart von Calciumionen bleiben. (B) eine L-förmige gemusterten ITO-Elektrode wurde galvanischen Alginat verwendet. Ein PDMS Vertiefung wurde mit der Elektrode befestigt, um eine grüne Fluoreszenz-markierten Alginat (1%) und CaCO 3 (0,5%) Abscheidungslösung enthalten. Nach galvanischen für 2 min. bei einer Stromdichte von 3 A / m 2 wurde die electroaddressed Alginat-Hydrogel durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Abbildung 2. Mitabscheidung Zellpopulationen. (A) Schematische Darstellung Interaktion zwischen zwei E. coli-Stämme: Eine Population produziert Autoinduktions-2 (AI-2), Ein Signalmolekül wird und als "AI-2 Absender." Die andere Population, als "AI-2-Empfänger," ist ein Reporter von AI-2, nach Erhalt der AI-2 durch Diffusion aus dem Absender, so drückt es der rot fluoreszierenden Proteins DsRed. (B) Red Fluoreszenzbild Elektrodenpaar mit dem AI-2 Absender Bevölkerung abgeschieden mit Alginat auf der linken Elektrode und AI-2-Empfänger Bevölkerung abgeschieden mit Alginat auf der rechten Elektrode. Vergrößerte Ansicht zeigt die DsRed-Expression von nur den AI-2-Empfängern. Abbildung 3. Chitosan Elektroabscheidung. (A) Schematische Darstellung des pH-abhängigen Elektrotauchlackier Chitosan. Die Elektrolyse von Wasser bei einer kathodisch vorgespannt Elektrode verursacht eine lokalisierte hohen pH-Wert (dargestellt durch eine lokalisierte Farbänderung eines pH-Indikator-Farbstoff in der Nähe der Kathode in-Aufnahme), die die Sol-Gel-Übergangstemperatur von Chitosan stimuliert in diesem Bereich. (B) Die Amine präsentieren auf Chitosan geben it pH-responsive Eigenschaften. Oberhalb eines pH-Wert von 6,3 (pKa von Chitosan) die Amine deprotoniert sind, erleichtern den Übergang von seiner protonierten löslicher Form in seine unlösliche Gel-Form. (C) eine strukturierte Goldelektrode wurde galvanischen Chitosan. Die Elektrode kathodisch mit der Stromversorgung verbunden ist, wurde in eine grüne Fluoreszenz-markierten Chitosan (0,8%) Abscheidung getaucht. Nach galvanischen für 2 min. bei einer Stromdichte von 4 A / m 2 wurde die electroaddressed Chitosanfilm durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. 4. Elektrochemische Transduktion mit einem funktionalisierten Chitosanfilm. (A) Schematische Darstellung der Aufbau einer Drei-Elektroden-System. Funktionalisierte Chitosan-Film dient als Arbeitselektrode, einen Platindraht als Gegenelektrode und eine Ag / AgCl Referenzelektrode. Elektrochemische Transduktion von Glukose verläuft über the enzymatische und elektrochemische Reaktionen gezeigt, wo hergestellt Wasserstoffperoxid oxidiert und an der Arbeitselektrode detektiert werden. (B) cyclische voltammagram (CV) an der Elektrode mit einem Chitosan-Film, die elektrochemisch konjugierten Glucoseoxidase (GOx) zeigt eine starke anodische Signal in einem 5 mM Glucose-Lösung. Ein Film, der keine GOx diente als Kontrolle und angezeigt kein Signal in der gleichen Lösung. (C) eine Standardkurve zwischen der anodischen Strom und der Glucosekonzentration zeigt eine nahezu lineare Beziehung (jeweils Aliquote erhöhte die Glucose-Konzentration von 4 mM und erhöhte auch die Stromamplitude in der eingesetzten Grafik in einer stufenweise). Abbildung 5. Protein-Funktionalisierung mit enzymatischen Montage. (A, oben) Schematische Darstellung Tyrosin-Tag "AI-2-Synthase" kovalent an ein Chitosan-Film durch die Tyrosinase Anordnung gebunden. Die Tyrosinreste geworden oxidMeerwasser mit einem O-Chinonen durch Tyrosinase verantwortlich und gegebenenfalls mit Amin-Gruppen auf dem Chitosan-Film zu reagieren, wobei eine kovalente Bindung. (A, unten) Das AI-2-Synthase erzeugt AI-2 von einem Substrat (SAH), die Empfängerzellen berichten die erzeugte KI-2 durch Fluoreszenz dsRed Expression. (B) Fluoreszenz-Bilder, die eine Chitosan-Film auf Gold, mit blau-markierten AI-2-Synthase funktionalisiert. Nebeneinander, werden AI-2-Empfänger-Zellen mit Alginat auf ITO abgeschieden. Nach Zugabe des enzymatischen Substrats zum Brunnen und Inkubation exprimieren die AI-2-Empfänger-Zellen dsRed.