1. % 1 agaroz-kaplı 24-kuyulu plakanın Hazırlanması Agaroz sterilize etmek için 250-500 ml şişe ve otoklavda 100 ml deiyonize su ile 1 gr agaroz (RPI, A20090-500) ekle (121 ° C, 15 psi, otoklav makinede 15 dk). Bir 70 ° C su banyosuna sterilize agaroz ile şişe aktarın. Agaroz bununla ilgili bir saat sürer 70 ° C'ye kadar soğutuldu, ne zaman döküldü üzere hazırdır. Her zaman agaroz steril tutmak için emin olun. 24-iyi düz alt plakalar (Falcon, 353.047) elde edilir; plakalar bir faz-kontrast mikroskop altında yansıma olabilir eğer 24 sıra düz alt levhaları her türlü çalışır. Biyogüvenlik kabini ve de eşit kapak yapmak için de etrafında girdap agaroz bir Eppendorf Repeater pipet ile her kuyuya agaroz 200 ul dağıtın. Agaroz 200 ul sferoidler tutarlıdır yuvarlak şekillerde oluşturacak şekilde, bir içbükey yüzeyi oluşturmak üzere uygundur. Az 200 ul agaroz olmayabilirde tamamen kapsayacak, ancak 200'den fazla ul agaroz içbükey yüzeyi ve üzerinde yetiştirilen sferoidler kuramazlar küresel şekillere olmayabilir. Agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar yaklaşık 10 dakika içinde kullanılmak üzere hazırdır. (İsteğe bağlı) önceden tohum hücrelerinin kültür ortamı ile agaroz dengelemek için orta 100 ul ekleyin. Alternatif olarak, agaroz tamamen katılaşmış sonra, her kuyuya 100 ul besi ekleyin ve steril koruyucu bant (Nunc, 236.366) ile tabak kapatın. Bu plakalar bir haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir. 2. Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması Tüm deneyler bir biyogüvenlik kabini içinde standart aseptik teknikler kullanılarak yapılır ve belirtilmediği sürece, tüm kültürlerin, havada% 5 CO 2 ile 37 ° C nemli inkübatör yetiştirilmektedir. İnsan pankreas NET BON-1 hücreleri% 10 fetal bovin serumu (FBS, Invitrogen ile DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) içinde tutulur100 mm 16.000-044) orta x 20 mm steril doku kültürü çanak (Corning, 430167). Tek tabakalı BON-1 hücreleri% 70-80 konfluent ulaştığında, orta kaldırılır. 37 hücreleri, 5 dakika inkübasyon ile 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) eklenerek ° C ile iki kez PBS ile yıkandı, ve bulaşık uzaklaştırıldı edilir TrypLE tripsin benzer, ancak 15 stabildir – 30 ° C de 4 ° C. Tüm hücreler çanak ayrılmış emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Tripsinize hücrelere 9 ml besiyeri ekleyin ve bir daha tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için birkaç kez aşağı hücrelerin Pipeti ve bir pipet kullanın. Hücrelerin filtre 70-um hücre süzgecinden (Fisher, 22.363.548) kullanın. Hücreleri toplayın ve Guava PCA-96 Base System (Millipore) kullanarak bir hücre sayımı yapmak. % 10 FBS büyüme medyumu ile fenol-free DMEM/F12 ml başına 5.000 hücre, bir süspansiyon hazırlamak. 3. Sfero Kültür Tek Overlay 200 ulHücre agaroz-kaplı 24-iyi levhaya süspansiyonlar ve buharlaştırma önlemek için steril sızdırmaz bantla 24-kuyucuklu plaklar içinde sızdırmazlık. Not: – kaplanacaktır hücrelerin sayısı gün 6 parçacıklarının boyutuna göre ampirik olarak tespit edilmelidir; parçacıklarının 300-400 mikron çapında ilaç tedavisine başlamak için ideal bir boyutu olacaktır; 1000 BON-1 ve H727 hücrelerinin levhalara edilir. – 3D hücrelerin canlılığı hakkında günlük 10 (veri lığa, gösterilmemiştir) düşüş başlarsa çünkü 6 gün sonra ilaç tedavileri başlayan önermiyoruz. Havada% 5 CO2 içeren bir 37 ° C'de bir gece boyunca nemli bir inkübatörde az 40 rpm'lik bir karıştırma çok yavaş bir çalkalamalı BON-1 hücreleri ile birlikte yukarıda agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar yerleştirin. Sonra kültürleri büyüyen tutmak için istikrarlı bir platform için bu plakaları taşıyın. Yukarıda plakanın her oyuğa 200 ul büyüme medyumu eklemes 3 günde. Sferoidler Rahatsız etmeyin. Iyi tarafına pipet dokunmadan ve kuyunun içine orta akış aşağı vererek her kuyunun duvarı boyunca orta eklemeyi deneyin. Bir mikroskop altında 24-kuyucuklu plaklar içinde steoid oluşumu izler. 4. İlaç Tedavisi Sferoidler gün 6 çapı 300-400 mikron çapında ulaştığınızda, 3D sferoidler ilaçlarla tedavi edilir. Bu ilaç tedavisi için günlük 0 olarak ifade edilir. Günlük 6, plakanın her ortam yaklaşık 400 ul içerir. 8 için yeterli çoğaltır olan bir 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml büyüme medyumu içinde ilacı stok yapılır ilaç tedavileri tedavileri için her bir doz, her sıra, 3x seri seyreltiler in 1x son konsantrasyonda olduğundan emin olmak için. 24-kuyulu plakanın her bir sıradaki sferoidler araç, dozu 1, 2, 3, 4 ve 5 olarak sınıflandırılır. 4 (bakınız bir 24-kuyucuklu plak üzerinde tedaviler, her doz için çoğaltır vardır <strong> Tablo 1). Biz genellikle en az en az 8 yapar tedavilerin her doz için çoğaltır 2 24-iyi plakaları, 3D sferoidler davranın. 4 az 5 dakika boyunca 800 rpm'de 24-iyi plaka aşağı spin ° sızdırmazlık bandı üzerindeki tüm terlemeyi iyi gider emin olmak için C. 3D parçacıklarının yüzer özelliği nedeniyle, her bir yanı içerisinde orta parçacıklarının rahatsız etmeyecek kaldırılır. Dikkatli bir şekilde, her sıra ile duvarı boyunca uygun kuyulara, her doz yukarıda hazırlanmış tedavilerin 200 ul ilave edin. Sızdırmazlık bandı ile 24-iyi yüzeyleri ve 37 kültürler inkübe ° C hava içinde% 5 CO ile nemlendirilmelidir inkübatör 2. Gerekirse, 72-96 saat sonra tedavi dozu ile ilgili olarak, her sıra sferoidler çekilmek. 5.. Monitör 3D Sfero Kültürler T Her kuyu başında ilaç tedavileri sonrasında her seçilen zaman noktası (0, 24, 48, 72 saat) olarak, sferoidlero 24-iyi plaka 5x objektif kullanarak Zeiss Axiovert 200/M-based faz-kontrast mikroskobu ile görüntülenmesi işlemidir. Not: Görüntüler mikron ve piksel arasında bir kalibre ölçekleme ile herhangi bir ışık mikroskobu alınabilir. Sferoidler hızlı bir şekilde 10x hedefi ile görüntüleme alanında büyümek çünkü 5x hedefi idealdir. Sfero analizi ile ham görüntüleri Zeiss AxioVision 4.8.2 Yazılımı kullanarak elle yapılabilir. Alternatif olarak, geliştirilmiş özel bir MATLAB programı otomatik / yarı-otomatik parçacıklarının boyutunu tahmin etmek için kullanılır. Otomatik program doğru verilen bir görüntüde sfero kontur bulmak ve otomatik olarak büyük (L) ve ikincil (W) eksenleri ölçmek için aktif kontur algoritması 4 uygular. Aynı algoritmasının bir yarı-otomatik versiyonu kullanıcılar kuvvetli dışlayıcı mevcut olduğunda programına başlatmak için olanak sağlar. Tüm görüntüleri TIFF veya JPEG dosya formatları olarak ihraç gerekirprogram tarafından okunacak ham görüntüleri. Sfero hacmi 0,5 x L x W 2 olarak tahmin edilmektedir. 6. NET 3D parçacıklarının HistoGel gömme 10-24 sferoidler, 2 saat süreyle% 10 formalin içinde çözülmüştür, iki kez PBS ile yıkandı, 24-kuyucuklu plaklar alınan% 50 ile yıkanır ve 15 dakika süreyle% 70 etanol iki kez, sırası ile, ve HistoGel gömme için hazırdır. Alternatif olarak, birkaç ay süreyle 4 ° C'de% 70 etanol içinde tutulabilir. Soğuk HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) bir tüp su dolu bir kabı konur. Kabı 1 dakika süreyle bir mikrodalga fırın içerisinde ısıtılması ve jel tamamen sıvılaştırılmış kadar, daha sonra her zaman aynı su dolu beher içinde tutulur. Yukarıdaki% 70 etanol içinde sferoidler bir kürdan kullanarak bir biyopsi cryomold (Doku-Tek, Sakura Finetek, 4565) aktarılır. Tüm sferoidler transfer olduğundan emin olun. Sferoidler biyo dibine batırmak için bir dakika bekletinpsy cryomold. Kimwipes ile biyopsi cryomold içinde sıvı kurtulmak ve bu arada, çok nazikçe atılabilir plastik Pasteur pipeti kullanarak biyopsi cryomold altındaki merkezine sferoidler itmeye çalışın. Bu aşama, bir mikroskop altında yapılabilir daha kolay olabilir. Isıtılmış HistoGel ince bir tabaka biyopsi cryomold altındaki sferoidler stabilize etmek için biyopsi cryomold ilave edilir, bu arada, kürdan çok yavaş bir şekilde biyopsi cryomold altındaki merkezinde sferoidler tutmak için kullanılır. Biyopsi cryomold altındaki sferoidler istikrar için yeterli çok HistoGel ekleyebilir ancak etmeyin. Sferoidler / HistoGel oda sıcaklığında veya HistoGel katılaşmış dek 1-2 dakika bekletin. Sonra ısıtılmış HistoGel ile biyopsi cryomold geri kalanını doldurun. Yaklaşık 10 dakika için oda sıcaklığında katılaşmaya izin verir. Hemen önce biyopsi cryomold, lea gelen sferoidler / HistoGel bloğu dışarı haşhaş içinbozulmadan sferoidler / HistoGel blok yuvalarından yardımcı 1 dakika, 4 ° C 'de bir ettik. Sferoidler / HistoGel blok sonra Bio-saran bir parça (Surgipath, 01.090) sarılmış ve bir doku ve biyopsi kaset (Fisher Scientific, 15-182-701D) konur. Doku ve biyopsi kaset% 70 etanol ile bir kap içinde saklanır. Daha sonra parafin gömme için rutin doku işleme prosedürleri takip edilmektedir. 5 Parafin blok 3-mikron kalınlığında tabaka slaytlara kesitli olabilir. Slaytlar histolojik değişikliklerini belirlemek için hematoksilin ve Eozin ile boyanmış edilebilir ve ayrıca immünohistokimyasal boyama için de kullanılabilir. 7. Temsilcisi Sonuçlar İnsan pankreas nöroendokrin tümör hücre hatları BON-1 (Kjell oberg, Uppsala Üniversitesi, İsveç tarafından Verto Enstitüsü sağlanan), QGP-1 (Japon Sağlık Bilimleri Vakfı, Osaka, Japonya), ve insan akciğer nöroendokrin tümör hücre hattı H727 (ATCC) idi Bir agaros üzerinde yetiştirilene-kaplı 24-kuyulu plakalı. Şekil 1 'de görüldüğü gibi, üç hücre çizgileri, farklı morfolojisi göstermektedir. BON-1 ve H727 hücreleri 3D sferoidler oluşmuştur. Mikroskop altında, H727 hücreleri BON-1 hücrelerden daha sıkı ve daha kompakt sferoidler gösterdi. Biz, H727 hücreleri hücre-hücre yapışması için artan bir kapasiteye sahip ve bir sonuç olarak daha sıkı bir birleşme oluştururlar hipotez. QGP-1 hücreleri sferoidler olarak kabul edilmemekte, büyük üzüm benzeri gözenekli kitleler, göstermektedir. Son yıllarda pankreas nöroendokrin tümör araştırma yükselen ilgi nedeniyle, BON-1 hücreleri rakamlar geri kalanı için kullanılır. Agaroz kaplı 24-iyi plaka üzerinde BON-1 hücreleri tohumlama sonra, çok hücreli sferoidler oluşumu genellikle 3. veya 4. gün ile oluşur sferoidler 6. gün yuvarlak olurlar. Besin ve oksijen sınırlaması nedeniyle, parçacıklarının yoğun çekirdekli hücreler günde 10 civarında ve günde 17 ile ölmeye başlar, sferoidler nedeniyle büyük olması ya da öylesine dağılmaya başlayabilirBana durumlarda nekrotik çekirdek ejeksiyon. Sferoidler genellikle çapı 1.000 mikron kadar büyüyebilir. Şekil 2 BON-1 3D parçacıklarının oluşumu, büyüme ve dağılma bölümlerini gösterir. Sferoidler 300-400 mikron çapında ve hücreler yüksek canlılığı (lığa) muhafaza olduğumuzda İlaç tedavileri başlandı. Gün 6 3D sferoidler ilaç tedavileri için başlangıç noktası olarak seçilmiştir. Bu histon deasetilaz inhibitörleri NET hücreleri üzerinde antiproliferatif ve proapoptotik etkiler göstermiştir olduğu rapor edilmiştir. 6 We A (TSA) 3D NET sferoidler üzerine ilaç tedavileri etkisini göstermek için bir örnek olarak kullanılabilir. Şekil 3A gösterir histon-deasetilaz inhibitörü-trichostatin tercih TSA. Şekil 3B, tedavi etmeye 3D parçacıklarının morfolojisi TSA (Sigma, T8552) tedavisi üzerine 3D parçacıklarının hacmi gösterir. Her bir steoid boyutu, bir cus tarafından otomatik olarak tahmin edildiMATLAB bilgisayar programı tom-geliştirdi. 4 A elle çizim adım, verilen bir resimde Kenara yakın olan sferoidler, edinmelerine yardımcı eklendi. En az 8 sferoidler her bir zaman noktasında TSA tedavilerin doz başına ölçüldü. Her 3D sfero hacmi 0.5 x Uzunluk x Genişlik 2 olarak hesaplandı. Gibi taşıt göreli Şekil 3A ve 3B, görüldüğü gibi, şekillerde gösterildiği TSA her doz BON-1 3D parçacıklarının büyüme inhibisyonu bir dereceye göstermiştir. Bunların arasında, 125 nM ve TCD ile 250 nM arasında konsantrasyonları kuvvetli 3D sferoidler büyümesini bastırılmış ve 96-saatlik bir zaman noktasında hücre ölümüne yol açmıştır. NET 3D parçacıklarının histoloji anlamak için, bir H & E ve immunohistokimyasal (İHK) boyama 17 gün kültüre edildi 3D sferoidler yapıldı. Şekil 4A önemli olan, HistoGel gömme için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem gösterilmektedir 3D spher ait parafin gömme için adım kortikostereoidlerle. Şekil 4B H & E boyama, bölünmüş kaspaz-3 (apoptotik hücreleri için bir belirteç) ve Ki-67 immünohistokimyasal (hücreler prolifere için bir belirteç) 3D sferoidler üzerindeki antikorlar, 17 gün boyunca kültüre edilmiş gösterir . 3D sferoidler çekirdek içinde hücreleri çoğunlukla nekrotik / apoptotik ve dış katman etkin bir hücre proliferasyon edilir. Şekil 1.. NET 3D parçacıklarının morfolojisi. Üç insan tümör hücre çizgileri nöroendokrin gelen 3D sferoidler agaroz-kaplı 24 oyuklu plakalar üzerinde oluşturulmaktadır. 1000 BON-1, H727 ve QGP-1 hücreleri agaroz-kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine ekildi ve protokolü de gösterildiği gibi, normal bir fizyolojik durumların içinde büyütülmüştür. Bu 10 gün kültüre edildi QGP-1 için BON-1 ve H727 veya hücre agrega, 3D parçacıklarının görüntülerdir. 18/4218fig2.jpg "alt =" Şekil 2 "/> Şekil 2. BON-1 3D parçacıklarının Büyüme Takibi BON-1 3D parçacıklarının büyüme izleme:. Oluşumu, büyüme ve 3D parçacıklarının parçalanması. Protokolü ayrıntılı olarak, 1000 BON-1 hücreleri agaroz-kaplı 24-iyi plaka üzerine kaplanır. Hücreler gecede fizyolojik bir durum bir çalkalamalı% 10 FBS ile standart bir DMEM/F12 ortamda üretilir, daha sonra istikrarlı bir platform üzerinde taşındı ve aynı şartlarda yetiştirilir. 3D hücrelerinin büyümesini izleme kaplama sonraki ilk saat boyunca 5 görüntüleme hücreler her saat takiben, ve daha sonra bir Zeiss Axiovert ile birlikte, her 1-3 günde bir 5x amacı kullanılarak faz kontrast mikroskobu 200/M-based edildi. İlk kitleler halinde toplu hücreler, sonra çok hücreli agrega, küçük sferoidler, büyük sferoidler ve sonunda sferoidler dağılacağı oluşturur. Şekil 3. BON-1 TSA Tedavi3D sferoidler. (A) TSA tedavisi üzerine 3D parçacıklarının Görüntüler. Tedavi grubu: V – Araç (0.0025% DMSO); D1 doz 1 (15.625 nM TSA), D2-2 doz (31,25 nM TSA), D3: doz 3 (62.5 nM TSA), D4: doz 4 (125 nM TSA ); D5: doz 5 (250 nM TSA). Tedavi Süresi: 0 H – Zaman noktaya günde 6 3D sferoidler başlayan tedaviler olduğunu, tedavi başladıktan sonra 24 H 48 H 72 H ve 96 H zaman noktaları vardır. 3D sferoidler her noktada daha önce olduğu gibi de görüntülendi. TSA tedavisi üzerine 3D parçacıklarının (B) Büyüme. (A) 'in 3D parçacıklarının majör (L) ve hafif (B) ekseni tedavisi, her bir zaman noktasında (0, 24, 48, 72 ve 96 saat) olarak Matlab programı tarafından otomatik olarak tahmin edildi. 3D parçacıklarının hacmi 0,5 x L x W 2 olarak tahmin edilmiştir. Grafikte steoid hacmi 8 ortalama çoğaltır olduğu ve bir hata çubuğu 8 çoğaltır baz hesaplandı. Tablo 1.Bir 24-kuyucuklu plak üzerinde ilaç tedavileri düzeni Şekil 4A. HistoGel gömülmesi için 3D sferoidler Süreç bir Yöntemi İllüstrasyon. HistoGel gömme ve 3D sferoidler (A) HistoGel gömme için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem genel bir bakış, immünohistokimyasal için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem. 3D sferoidler biyopsi cryomold aynı düzeyde, daha sonra HistoGel / sferoidler blok Bio-atkıları mavi sarılmış ve parafine gömme için sarı biyopsi kaset aktarıldı olmak için bir HistoGel içinde muhafaza edildi. Şekil 4B. H & E Boyama ve gün-17 3D parçacıklarının immünohistokimyasal boyanma. (B) H & E boyama, immünhistokimyasal Ki-67 boyanma ve 17 günlük 3D parçacıklarının parçalanabilen Kaspaz-3. Paraffin gömülü kesitli slaytlar deparaffinized olduğunu ve antijen alımı CCI (Hücre Kondisyon Çözüm, Verana Medical System, # 711-065-152) kullanılarak yapıldı. Tavşan poliklonal Ki-67 antikoru (Abcam. # Ab833) ve parçalanabilen kaspaz 3 antikoru (Celi Technology Sinyalleşme, # 9661), oda sıcaklığında 1 saat boyunca, sırasıyla, 1:75 ve 1:200 bir konsantrasyonda uygulanmıştır. Anti-tavşan sekonder antikoru (Jackson Immunolab, # 711-065-152) kromojenik saptama kiti DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124), ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1:500 uygulanmıştır. Slaytlar Hematoksilin ve susuz ile zıt ve Ksilen gelen coverslipping önce temizlendi.