1. Préparation de 1% d'agarose-couché de 24 puits Plaque Ajouter une g d'agarose (RPI, A20090-500) à 100 ml d'eau désionisée dans une bouteille 250-500 ml et autoclave pour stériliser l'agarose (121 ° C, 15 psi, 15 min dans une machine à autoclave). Transfert de la bouteille avec stérilisés agarose dans un bain de 70 ° C l'eau. L'agarose est prêt à être versé quand il est refroidi à 70 ° C, qui dure environ une heure. Assurez-vous de garder le stérile agarose à tout moment. Procurez-vous les 24 et à fond plat (Falcon plaques, 353047); n'importe quel type de 24 puits à fond plat plaques pourrait fonctionner que si les plaques peuvent être visualisés au microscope à contraste de phase. Distribuer 200 ul d'agarose à chaque puits avec une pipette à répétition Eppendorf dans une enceinte de sécurité biologique et le tourbillon de l'agarose autour du puits pour lui faire couvrir le bien uniformément. 200 pi de l'agarose est approprié pour former une surface concave de telle sorte que sphéroïdes peut former des formes sphériques cohérentes. Moins de 200 ul d'agarose ne peut pascouvrir le bien entièrement, mais plus de 200 ul d'agarose ne peuvent pas former la surface concave et les sphéroïdes cultivés sur il ne peut pas former des formes sphériques. Les agarose revêtues plaques à 24 puits sont prêts à être utilisé dans environ 10 min. (Facultatif) Ajouter 100 ul de milieu pour équilibrer l'agarose avec un milieu de culture avant ensemencement des cellules. Sinon, après l'agarose est complètement solidifiée, ajouter 100 ul milieu de croissance dans chaque puits et sceller les plaques avec du ruban d'étanchéité stérile (Nunc, 236366). Ces plaques peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. 2. Préparation de suspensions de cellules individuelles Toutes les expériences sont effectuées en utilisant les techniques standards d'asepsie dans une enceinte de biosécurité et de toutes les cultures sont cultivées à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2 dans l'air, sauf indication contraire. Pancréatiques humaines NET BON-1 cellules sont maintenues en DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS, Invitrogen,16000-044) dans un milieu de 100 mm x 20 mm stérile boîte de culture de tissus (Corning, 430167). Lorsque monocouches BON-1 cellules atteignent 70-80% de confluence, milieu est éliminé. Les cellules sont lavées avec du PBS deux fois, et délogé de la vaisselle en ajoutant 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) avec 5 minutes d'incubation à 37 ° C. TrypLE est similaire à la trypsine, mais est stable à 15 – 30 ° C, ainsi que à 4 ° C. Vérifiez sous microscope pour s'assurer toutes les cellules se détachent de l'antenne. Ajouter 9 ml milieu de croissance pour les cellules trypsinisées et utiliser une pipette pour introduire à la pipette les cellules de haut en bas à quelques reprises pour assurer une suspension de cellules, même seule. Utilisation de cellules de 70 um crépine (Fisher, 22363548) pour filtrer les cellules. Recueillir les cellules et d'effectuer un comptage des cellules à l'aide Goyave PCA-96 système de base (Millipore). Préparer une suspension de 5000 cellules par ml dans du phénol sans DMEM/F12 avec le milieu de croissance de 10% de FBS. 3. Culture Sphéroïde Overlay 200 pi de la seulesuspensions cellulaires à l'agarose-couché de 24 puits de plaque et sceller les plaques à 24 puits avec la bande d'étanchéité stérile pour éviter l'évaporation. Remarque: – Le nombre de cellules à plaquer doit être déterminé de manière empirique basée sur la taille des sphéroïdes à jour 6; 300-400 um de diamètre des sphéroïdes serait la taille idéale pour le démarrage du traitement de la toxicomanie, 1000 BON-1 et H727 cellules sont étalées. – Nous ne vous recommandons de commencer les traitements médicamenteux après 6 jours parce que la viabilité des cellules en 3D commence à baisser à environ 10 jours (données non présentées, manuscrit en préparation). Placez les au-dessus d'agarose recouvertes de plaques de 24 puits avec BON-1 des cellules sur un agitateur orbital à une agitation très lente de moins de 40 tours par minute pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C humidifié avec 5% de CO 2 dans l'air. Puis déplacez ces plaques à une plate-forme stable pour maintenir les cultures en pleine croissance. Ajouter 200 ul de milieu de croissance chaque puits de la plaque au-dessuss tous les 3 jours. Ne dérangez pas les sphéroïdes. Essayer d'ajouter du milieu à travers la paroi de chaque puits en touchant la pointe de pipette sur le côté du puits et en laissant le flux de fluide vers le bas dans le puits. Surveiller la formation sphéroïde dans les plaques à 24 puits sous un microscope. 4. Traitement de la toxicomanie Lorsque les sphéroïdes atteindre environ 300-400 m de diamètre au jour 6, les sphéroïdes 3D sont traités avec des médicaments. Ceci est indiqué que 0 jours pour le traitement médicamenteux. Au jour 6, chaque puits de la plaque contient environ 400 pi de milieu. Pour s'assurer que les traitements médicamenteux sont à une concentration finale 1x dans chaque puits, 3x dilutions en série de chaque dose de traitements sont effectués à partir du stock de médicaments dans 5 ml milieu de croissance dans un tube de 15 ml conique, ce qui est suffisant pour 8 répétitions. Les sphéroïdes à chaque rangée de la plaque de 24 puits sont classés en tant que véhicule, dose de 1, 2, 3, 4 et 5. Il ya 4 répétitions pour chaque dose de traitements sur une plaque de 24 puits (voir <strong> Tableau 1). Nous avons l'habitude traiter sphéroïdes 3D au moins 2 plaques à 24 puits, ce qui fait au moins 8 répétitions pour chaque dose de traitements. Centrifuger la plaque de 24 puits à 800 rpm pendant 5 min à 4 ° C afin de s'assurer que tous les condensations sur la bande d'étanchéité vont dans le puits. En raison de la fonction flottante des sphéroïdes 3D, le milieu de chaque puits ne sont pas supprimées pour éviter la perturbation des sphéroïdes. Ajouter avec précaution 200 pi des traitements ci-dessus faits de chaque dose dans les puits appropriés le long du mur de chaque puits. Sceller les plaques à 24 puits avec la bande d'étanchéité et incuber les cultures dans le 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2 dans l'air. Si nécessaire, retirer les sphéroïdes à chaque bien avec la dose respective de traitements après 72-96 h. 5. Moniteur 3D cultures Sphéroïde À chaque point de temps choisi, après les traitements médicamenteux (0, 24, 48, 72 h), les sphéroïdes à chaque puits de til à 24 puits de plaque sont imagés avec un Zeiss Axiovert 200/M-based à contraste de phase microscope en utilisant un objectif 5x. Remarque: Les images peuvent être prises sur n'importe quel microscope optique avec une échelle étalonnée entre um et pixel. Un objectif 5x est idéal parce que les sphéroïdes rapidement dépasser le domaine de l'imagerie avec un objectif 10x. Analyse Sphéroïde peut être effectuée manuellement en utilisant Zeiss AxioVision 4.8.2 du logiciel avec les images brutes. Alternativement, un programme personnalisé développé MATLAB est utilisé pour estimer la taille des sphéroïdes automatiquement / semi-automatique. Le programme automatique en oeuvre l'algorithme de contour actif 4 pour localiser avec précision le contour du sphéroïde dans une image donnée et mesurer sa majeure (L) et mineures (W) haches automatiquement. Une version semi-automatique de la même algorithme permet aux utilisateurs de contribuer à lancer le programme quand artefact forte est présente. Toutes les images doivent être exportés au format TIFF ou JPEG à partir des formats de fichiersles images brutes à être lues par le programme. Le volume du sphéroïde est estimée à 0,5 x L x P 2. 6. HistoGel-enrobage des sphéroïdes NET 3D 10-24 sphéroïdes sont recueillis à partir des plaques à 24 puits, lavées dans du PBS deux fois, fixé dans du formol 10% pendant 2 heures, lavées dans 50% et 70% d'éthanol pendant 15 min à deux reprises, respectivement, et sont prêts pour l'incorporation HistoGel. Alternativement, ils peuvent être conservés dans l'éthanol à 70% à 4 ° C pendant plusieurs mois. Un tube de froid HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) est placé dans un bécher rempli d'eau. Le récipient est chauffé dans un four micro-ondes pendant 1 min ou jusqu'à ce que le gel est complètement liquéfié, puis maintenu dans le même récipient rempli d'eau en tout temps. Les sphéroïdes de l'éthanol à 70% par rapport à ci-dessus sont transférés dans un cryomold biopsie (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) en utilisant un cure-dent. Assurez-vous que tous les sphéroïdes sont transférés. Laissez-les sphéroïdes reposer pendant une minute à couler vers le bas de la biopsy cryomold. Essayez de vous débarrasser des liquides dans le cryomold biopsie avec Kimwipes et en attendant, très doucement pousser les sphéroïdes au centre au bas de l'cryomold biopsie à l'aide de la pipette Pasteur en plastique jetable. Cette étape peut être plus facile à faire en vertu d'un microscope à dissection. Une fine couche de HistoGel chauffé est ajouté à la cryomold biopsie afin de stabiliser les sphéroïdes au bas de l'cryomold biopsie, en attendant, le cure-dent est utilisé pour garder les sphéroïdes au centre au bas de la biopsie cryomold très doucement. Ne pas ajouter HistoGel trop mais juste assez pour stabiliser les sphéroïdes en bas de l'cryomold biopsie. Laissez-les sphéroïdes ou HistoGel reposer pendant 1-2 min à température ambiante ou jusqu'à ce que le HistoGel est solidifié. Ensuite, remplissez le reste de la cryomold biopsie avec le HistoGel réchauffé. Laisser se solidifier à la température ambiante pendant environ 10 min. Juste avant popping out des sphéroïdes par bloc HistoGel de la cryomold biopsie, leail ve à 4 ° C pendant 1 min, ce qui contribue à éclater les sphéroïdes intact / bloc HistoGel. Les sphéroïdes par bloc HistoGel est ensuite enveloppé dans un morceau de Bio-emballages (Surgipath, 01090) et mis dans un mouchoir et la cassette biopsie (Fisher Scientific, 15-182-701D). Le tissu de cassette et biopsie est stocké dans un récipient avec de l'éthanol à 70%. Ensuite, les procédures de routine de traitement des tissus pour inclusion en paraffine sont suivis 5. Le bloc de paraffine peut être divisé en 3-um glissements de couches épaisses. Les diapositives peuvent être colorées à l'hématoxyline et l'éosine pour déterminer les changements histologiques et peut également être utilisé pour la coloration immunohistochimique. 7. Les résultats représentatifs Neuroendocrines du pancréas humain des lignées cellulaires tumorales BON-1 (à condition d'Verto Institut par Kjell Oberg, l'Université d'Uppsala, Suède), PQG-1 (japonais Health Sciences Foundation, Osaka, Japon), et l'homme du poumon neuroendocrine la lignée cellulaire tumorale H727 (ATCC) ont été cultivé sur un agarose-revêtu à 24 puits plaque. Comme on le voit dans la figure 1, les trois lignées cellulaires montrent morphologie différente. Cellules BON-1 et H727 formé sphéroïdes 3D. Sous le microscope, les cellules ont montré H727 sphéroïdes plus strictes et plus compact que BON-1 des cellules. Nous émettons l'hypothèse que les cellules H727 ont une capacité accrue pour adhésion cellule-cellule et forment le resserrement des jonctions en tant que résultat. PQG-1 des cellules montrent de grandes raisin comme masses poreuses, qui ne sont pas considérés comme des sphéroïdes. En raison de l'intérêt croissant de la recherche tumeur pancréatique neuroendocrine ces dernières années, BON-1 cellules sont utilisées pour le reste des chiffres. Après l'ensemencement BON-1 des cellules sur l'agarose-couché de 24 puits de plaque, la formation multicellulaire sphéroïdes se produit généralement à la journée 3 e ou 4 e et les sphéroïdes s'arrondissent par le 6 e jour. En raison de la limitation en nutriments et en oxygène, les cellules dans le noyau dense des sphéroïdes commencent à mourir autour du jour 10 et le jour 17, les sphéroïdes commencent à se désintégrer en raison de la grande taille ou dans lame cas l'éjection du noyau nécrotique. Les sphéroïdes peuvent généralement atteindre jusqu'à 1000 m de diamètre. La figure 2 montre les sections de la formation, la croissance et de la désintégration de Bon-1 sphéroïdes 3D. Les traitements médicamenteux ont été a commencé quand sphéroïdes étaient alentours de 300-400 um et les cellules conservées viabilité élevée (manuscrit en préparation). Jour 6 sphéroïdes 3D ont été choisis comme point de départ pour les traitements médicamenteux. Il a été rapporté que les inhibiteurs d'histone déacétylase ont montré des effets anti-prolifératifs et pro-apoptotique sur les cellules NET 6. Nous avons choisi l'histone-désacétylase inhibiteur trichostatine Un 3A (TSA) comme un exemple pour illustrer l'effet des traitements médicamenteux sur les sphéroïdes 3D NET. Figure montre la morphologie des sphéroïdes 3D sur le traitement de la TSA. La figure 3B montre le volume des sphéroïdes 3D sur TSA (Sigma, T8552) de traitement. La taille de chaque sphéroïde individuelle a été estimée automatiquement par un CUStom-développé un programme informatique MATLAB. 4 A l'étape dessin manuel a été ajouté pour aider à acquérir les sphéroïdes, qui étaient près du bord dans une image donnée. Au moins 8 sphéroïdes ont été mesurés par dose de traitements TSA à chaque instant. Le volume de chaque ellipsoïde 3D a été calculé que 0,5 Longueur x Largeur x 2. Comme on le voit sur la figure 3A et 3B, par rapport au véhicule, toutes les doses de TSA indiqués dans les chiffres montrent un certain degré d'inhibition de croissance de Bon-1 sphéroïdes 3D. Parmi eux, les concentrations de 125 nM et 250 nM de TSA fortement inhibé la croissance de sphéroïdes 3D et a conduit à la mort cellulaire à 96 h-point dans le temps. Pour comprendre l'histologie des sphéroïdes NET 3D, un H & E et immunohistochimique (IHC) coloration ont été effectuées sur sphéroïdes 3D qui avait été cultivés pendant 17 jours. Figure 4A illustre une méthode pour traiter sphéroïdes 3D pour l'incorporation HistoGel, qui est la clé étape pour inclusion dans la paraffine de la 3D Spher OID. Figure 4B montre la coloration H & E, la coloration immunohistochimique de la clivée caspase-3 (un marqueur des cellules apoptotiques) et Ki-67 (un marqueur de la prolifération des cellules) des anticorps sur sphéroïdes 3D, qui avait été mis en culture pendant 17 jours . Les cellules à l'intérieur du noyau des sphéroïdes 3D sont pour la plupart nécrotique / apoptotique et les cellules de la couche extérieure sont en prolifération active. Figure 1. La morphologie du NET Sphéroïdes 3D. Les sphéroïdes 3D à partir de trois humains des lignées cellulaires tumorales neuroendocrines sont formés sur agarose recouvertes de plaques à 24 puits. 1000 cellules BON-1, H727 et PQG-1 ont été ensemencées sur agarose recouvertes de plaques à 24 puits et cultivées dans un état physiologique normal tel que détaillé dans le protocole. Ce sont les images de sphéroïdes 3D pour le BON-1 et H727 ou de la cellule agrégats pour PQG-1, qui ont été cultivés pendant 10 jours. 18/4218fig2.jpg "alt =" Figure 2 "/> Figure 2. Le suivi de la croissance de Bon-1 Sphéroïdes 3D Le suivi la croissance de sphéroïdes BON-3D: 1. La formation, de croissance et de la désintégration de sphéroïdes 3D. Comme il est précisé dans le protocole, 1000 BON-1 cellules sont étalées sur un enduit d'agarose de 24 puits de plaque. Les cellules sont cultivées dans une norme DMEM/F12 avec FBS 10% sur un agitateur orbital dans un état physiologique du jour au lendemain, puis déplacée sur une plate-forme stable et a grandi dans le même état. La croissance de suivi des cellules 3D ont été suivies par les cellules d'imagerie à toutes les heures pour la première fois 5 heures après le placage, puis tous les 1-3 jours avec un Zeiss Axiovert 200/M-based à contraste de phase microscope en utilisant un objectif 5x. Les cellules agrégées en masses d'abord, puis former des agrégats multicellulaires, sphéroïdes petites, plus grandes sphéroïdes, et, éventuellement, les sphéroïdes se désagrègent. Figure 3. Traitement TSA BON-1Sphéroïdes 3D. (A) Images de sphéroïdes 3D sur le traitement TSA. Traitement groupe: V – Véhicule (0,0025% de DMSO); D1-dose de 1 (15,625 nM TSA); D2-dose de 2 (31,25 nM TSA); D3: dose de 3 (62,5 nM TSA); D4: une dose de 4 (125 nM TSA ); D5: une dose de 5 (250 nM TSA). Temps de traitement: 0 h – point de temps que les traitements ont commencé le jour 6 sphéroïdes 3D; 24 H, 48 h, 72 h et 96 h sont les points dans le temps après les traitements ont commencé. Sphéroïdes 3D ont été imagées à chaque point dans le temps comme avant. (B) La croissance des sphéroïdes 3D sur le traitement TSA. Les grandes (L) et mineur (W) axes des sphéroïdes 3D dans (A) ont été estimés automatiquement par le programme Matlab à chaque point dans le temps des traitements (0, 24, 48, 72 et 96 h). Le volume des sphéroïdes 3D a été estimée à 0,5 x L x P 2. Le volume du sphéroïde dans le graphique était la moyenne de 8 répétitions et la barre d'erreur a été calculé sur la base de 8 répétitions. Tableau 1.Disposition des traitements médicamenteux sur une plaque de 24 puits Figure 4A. Illustration d'une méthode de traitement des sphéroïdes 3D pour Embedding HistoGel. Une méthode pour traiter sphéroïdes 3D pour l'incorporation HistoGel et la coloration immunohistochimique des sphéroïdes 3D (A) Un aperçu d'une méthode pour traiter sphéroïdes 3D pour incorporer HistoGel. Sphéroïdes 3D ont été encapsulés dans un HistoGel être au même niveau dans le cryomold biopsie, puis le HistoGel / bloc sphéroïdes a été enveloppé dans un bleu Bio-emballages et transféré dans une cassette jaune biopsie pour inclusion dans la paraffine. La figure 4B. Coloration H & E et la coloration immunohistochimique de la journée-17 Sphéroïdes 3D. (B) coloration H & E, coloration immunohistochimique de Ki-67 et clivé Caspase-3 des sphéroïdes de 17 jours 3D. Le paraffin-embarqués diapositives sectionnées étaient déparaffinées et la récupération d'antigène a été effectuée à l'aide de l'ICC (solution de conditionnement portable, Verana Medical System, # 711-065-152). Polyclonal de lapin Ki-67 anticorps (Abcam. # Ab833) et clivé Caspase 3 anticorps (Cell Signaling Technology, # 9661) ont été appliqués à une concentration de 1:75 et 1:200, respectivement, pendant 1 h à température ambiante. L'anticorps secondaire anti-lapin (Jackson Immunolab, # 711-065-152) a été appliqué à 1:500 pendant 1 h à température ambiante, suivie par une trousse de détection chromogénique DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Les lames ont été contre-colorées avec l'hématoxyline et déshydraté et effacé avant de lamelles de xylène.
