Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell'uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

1. Preparazione di 1% agarosio rivestita 24-pozzetti Aggiungere 1 g di agarosio (RPI, A20090-500) a 100 ml di acqua deionizzata in un flacone 250-500 ml e autoclave per sterilizzare l'agarosio (121 ° C, 15 psi, 15 min in una macchina autoclave). Trasferire la bottiglia con sterilizzato agarosio in un bagno di acqua 70 ° C. L'agarosio è pronta per essere versata quando è raffreddata a 70 ° C, che richiede circa un'ora. Assicurarsi di mantenere la sterile agarosio in ogni momento. Ottenere i 24 pozzetti a fondo piatto piastre (Falcon, 353.047), qualsiasi tipo di 24 pozzetti a fondo piatto piatti avrebbe funzionato se i piatti possono essere esposte sotto un microscopio a contrasto di fase. Dispensare 200 ul di agarosio ad ogni pozzetto con una pipetta Eppendorf ripetitore in un armadio biosicurezza e agitare la agarosio intorno al pozzo per farlo coprire il bene in modo uniforme. 200 pl di agarosio è appropriato per formare una superficie concava in modo che sferoidi possono formare le forme sferiche coerenti. Meno di 200 pl agarosio non puòcoprire il pozzo interamente, ma più di 200 pl di agarosio non può formare la superficie concava e gli sferoidi coltivate su di esso non può formare forme sferiche. Le agarosio rivestite piastre da 24 pozzetti sono pronti per essere utilizzati in circa 10 min. (Facoltativo) Aggiungere 100 ul di mezzo per equilibrare l'agarosio con terreno di coltura prima della semina delle cellule. In alternativa, dopo l'agarosio è completamente solidificato, aggiungere 100 microlitri terreno di crescita a ciascun pozzetto e le piastre sigillare con il nastro sigillante sterile (Nunc, 236.366). Queste piastre possono essere conservati a 4 ° C per una settimana. 2. Preparazione di sospensioni di cellule singole Tutti gli esperimenti sono fatte usando le tecniche standard asettiche in un armadio biosicurezza e tutte le colture vengono coltivate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 in aria, se non specificato. Pancreatico umano NET BON-1 cellule sono mantenute in DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) con 10% siero fetale bovino (FBS, Invitrogen,16000-044) in un mezzo mm 100 x 20 mm sterile piastra di coltura tissutale (Corning, 430.167). Quando monostrato BON-1 le cellule raggiungere il 70-80% di confluenza, il mezzo viene rimosso. Le cellule vengono lavate due volte con PBS, e rimosse dalla piastra mediante l'aggiunta di 1 ml Triplo (Invitrogen, 12604) con 5 minuti di incubazione a 37 ° C. Triplo è simile a tripsina, ma è stabile a 15 – 30 ° C nonché a 4 ° C. Controllare al microscopio per assicurarsi che tutte le cellule si staccano dal piatto. Aggiungi 9 ml terreno di crescita per le cellule tripsinizzate e usare una pipetta di dispensare le cellule su e giù un paio di volte per assicurare una sospensione di cellule ancora singola. Utilizzare 70-um cell filtro (Fisher, 22.363.548) per filtrare le cellule. Raccogliere le cellule e di eseguire una conta di cellule utilizzando Guava PCA-96 Sistema di Base (Millipore). Preparare una sospensione di 5000 cellule per ml in fenolo-free DMEM/F12 con 10% di crescita medio FBS. 3. Cultura sferoide Overlay 200 pl del singolosospensioni cellulari al agarosio rivestita 24-pozzetti e sigillare le piastre a 24 pozzetti con il nastro sigillante sterile per impedire l'evaporazione. Nota: – Il numero di cellule da rivestire deve essere determinato empiricamente sulla base delle dimensioni degli sferoidi al giorno 6; 300-400 micron di diametro degli sferoidi sarebbe la dimensione ideale per iniziare il trattamento farmacologico; 1.000 BON-1 e H727 cellule vengono piastrate. – Si consiglia di non iniziare trattamenti farmacologici dopo giorno 6, perché la vitalità delle cellule 3D inizia a calare a circa 10 giorni (dati non mostrati, manoscritto in preparazione). Posizionare i suddetti agarosio rivestite piastre da 24 pozzetti con cellule BON-1 su un agitatore orbitale a una agitazione molto lenta inferiore a 40 rpm durante la notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 in aria. Poi spostare questi piatti per una piattaforma stabile per mantenere le colture in crescita. Aggiungere 200 pl mezzo di crescita a ciascun pozzetto della piastra sopras ogni 3 giorni. Non disturbare le sferoidi. Prova di aggiungere mezzo attraverso la parete di ciascun pozzetto toccando la punta della pipetta sul lato del pozzo e lasciando la portata media nel pozzo. Monitorare la formazione sferoide nelle piastre da 24 pozzetti sotto un microscopio. 4. Drug Treatment Quando le sferoidi raggiungere circa 300-400 micron di diametro al giorno 6, le sferoidi 3D sono trattati con farmaci. Questo è indicato come 0 giorni per il trattamento farmacologico. Al giorno 6, ciascun pozzetto della piastra contiene circa 400 pl di mezzo. Per assicurarsi che i trattamenti farmacologici sono a 1x concentrazione finale in ciascun pozzetto, 3x diluizioni seriali di ogni dose di trattamenti sono realizzati con lo stock di droga in 5 ml di terreno di coltura in una provetta 15 ml conica, che è sufficiente per 8 repliche. Gli sferoidi ad ogni riga della piastra da 24 pozzetti sono classificati come veicolo, la dose 1, 2, 3, 4 e 5. Esistono 4 repliche per ogni dose di trattamenti su una piastra da 24 pozzetti (vedi <strong> Tabella 1). Di solito trattare sferoidi 3D almeno 2 in piastre da 24 pozzetti, che rende almeno 8 repliche per ogni dose di trattamenti. Centrifugare la piastra da 24 pozzetti a 800 rpm per 5 min a 4 ° C per assicurarsi che tutte le condensazioni sul nastro sigillante passare nel pozzo. Grazie alla caratteristica flottante delle sferoidi 3D, il mezzo in ciascun pozzetto non viene rimosso per evitare perturbazioni degli sferoidi. Cautela aggiungere 200 pl di sopra fatte trattamenti di ciascuna dose nei pozzetti appropriati lungo la parete di ciascun pozzetto. Sigillare le piastre da 24 pozzetti con il nastro adesivo e incubare le culture nel 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2 in aria. Se necessario, gli sferoidi ritirarsi in ciascun pozzetto con la dose rispettiva trattamenti dopo 72-96 ore. 5. Monitor 3D sferoidali Culture Ad ogni punto di tempo scelto dopo trattamenti farmacologici (0, 24, 48, 72 ore), le sferoidi in ciascun pozzetto della tegli 24-pozzetti sono ripreso con un Zeiss Axiovert 200/M-based microscopio a contrasto di fase usando un obiettivo 5x. Nota: le immagini possono essere prese su qualsiasi microscopio ottico con una scala calibrata tra pm e pixel. Un obiettivo 5x è l'ideale perché gli sferoidi rapidamente troppo grande per il campo di imaging con un obiettivo 10x. Analisi sferoide può essere eseguita manualmente utilizzando Zeiss AxioVision 4.8.2 del software con le immagini in formato raw. In alternativa, un programma personalizzato sviluppato MATLAB viene utilizzato per stimare la dimensione degli sferoidi automaticamente / semi-automaticamente. Il programma automatico implementa l'algoritmo attivo contorno 4 per localizzare con precisione contorno dello sferoide in una data immagine e misurare il suo principale (L) e minori (W) assi automaticamente. Una versione semi-automatica dello stesso algoritmo consente agli utenti di aiutare avviare il programma quando manufatto forte è presente. Tutte le immagini devono essere esportati come formati di file TIFF o JPEG dale prime immagini da leggere dal programma. Il volume dello sferoide è stimato come 0,5 x L x W 2. 6. HistoGel-embedding delle sferoidi NET 3D 10-24 sferoidi sono raccolti dalle piastre da 24 pozzetti, lavate due volte in PBS, fissate in formalina al 10% per 2 ore, lavato in 50% e 70% di etanolo per 15 min due volte, rispettivamente, e sono pronti per l'incorporamento HistoGel. In alternativa, essi possono essere tenuti in etanolo 70% a 4 ° C per diversi mesi. Un tubo di freddo HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) viene messo in un bicchiere pieno d'acqua. Il beaker viene riscaldata in un forno a microonde per 1 minuto o fino a che il gel è completamente liquefatto, quindi tenuta stesso pieno d'acqua becher in ogni momento. Gli sferoidi nel 70% di etanolo dall'alto vengono trasferiti in un cryomold biopsia (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) con uno stuzzicadenti. Assicurarsi che tutti i sferoidi vengono trasferiti. Sia gli sferoidi riposare per un minuto per affondare fino al fondo del biopsy cryomold. Prova a liberarsi dei liquidi in cryomold biopsia con Kimwipes e nel frattempo, molto delicatamente spingere i sferoidi al centro nella parte inferiore della biopsia cryomold utilizzando la pipetta Pasteur monouso in plastica. Questo passaggio potrebbe essere più facile da fare sotto un microscopio da dissezione. Un sottile strato di HistoGel riscaldata viene aggiunto al cryomold biopsia per stabilizzare gli sferoidi sul fondo del cryomold biopsia, intanto, il stuzzicadenti viene utilizzato per mantenere gli sferoidi al centro nella parte inferiore del cryomold biopsia delicatamente. Non aggiungere HistoGel troppo ma appena sufficiente per stabilizzare gli sferoidi sul fondo del cryomold biopsia. Lasciate che i sferoidi / HistoGel riposare per 1-2 minuti a temperatura ambiente o fino al HistoGel è solidificato. Poi riempire il resto del cryomold biopsia con il HistoGel riscaldata. Lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 10 min. Appena prima di saltar fuori gli sferoidi / blocco HistoGel dal cryomold biopsia, leave lo a 4 ° C per 1 min, che aiuta a saltar fuori gli sferoidi intatte / blocco HistoGel. Gli sferoidi / block HistoGel viene poi avvolto in un pezzo di Bio-impacchi (Surgipath, 01.090) e messo in un fazzoletto e cassette biopsia (Fisher Scientific, 15-182-701D). Il tessuto e la cassetta biopsia è memorizzato in un contenitore con etanolo 70%. Poi le procedure di routine di trasformazione dei tessuti in paraffina sono state seguite. 5 Il blocco paraffina può essere sezionato in 3-um vetrini strato di spessore. I vetrini possono essere colorate con ematossilina ed eosina di determinare alterazioni istologiche e può anche essere utilizzato per la colorazione immunoistochimica. 7. Risultati rappresentativi Neuroendocrini pancreatici umani linee cellulari tumorali BON-1 (fornito Verto Istituto da Kjell Oberg, Uppsala University, Svezia), QGP-1 (giapponese Health Sciences Foundation, Osaka, Giappone), e umano delle cellule tumorali del polmone neuroendocrine linea H727 (ATCC) sono stati coltivate su un agarose rivestita con 24-pozzetti. Come si vede nella figura 1, le tre linee cellulari mostrano morfologia differente. Cellule BON-1 e H727 formato sferoidi 3D. Sotto il microscopio, H727 cellule mostravano sferoidi strette e più compatto rispetto BON-1 le cellule. Noi ipotizziamo che H727 cellule hanno una maggiore capacità di adesione cellula-cellula e formare giunzioni strette come risultato. QGP-1 le cellule mostrano grandi masse porose uva-simili, che non sono considerati sferoidi. A causa della crescente interesse della ricerca tumore pancreatico neuroendocrino negli ultimi anni, BON-1 cellule vengono usate per il resto delle figure. Dopo la semina BON-1 le cellule sulla agarosio rivestite con piastra da 24 pozzetti, la formazione di sferoidi multicellulari si verifica in genere entro il giorno 3 ° e 4 ° e gli sferoidi rounder diventano di giorno in giorno 6 °. A causa della limitazione da nutrienti e ossigeno, cellule del nucleo denso degli sferoidi iniziano a morire circa 10 giorni e per giorno 17, gli sferoidi cominciano a disintegrarsi a causa delle dimensioni grandi o nellame casi l'espulsione del nucleo necrotico. Gli sferoidi tipicamente può crescere fino a 1000 micron di diametro. Figura 2 mostra le sezioni della crescita formazione, e la disintegrazione di BON-1 sferoidi 3D. Trattamenti farmacologici sono stati avviati quando sferoidi sono stati di circa 300-400 micron e le cellule mantenuto alta vitalità (manoscritto in preparazione). Giorno 6 sferoidi 3D sono stati scelti come punto di partenza per trattamenti farmacologici. E 'stato riportato che gli inibitori delle istone deacetilasi ha dimostrato effetti antiproliferativi e pro-apoptotica sulle cellule NET. 6 Abbiamo scelto la istone-deacetilasi-inibitore tricostatina A (TSA) come un esempio per illustrare l'effetto di trattamenti farmacologici in 3D sferoidi NET. Figura 3A mostra la morfologia degli sferoidi 3D sul trattamento di TSA. Figura 3B mostra il volume degli sferoidi 3D su TSA (Sigma, T8552) trattamento. La dimensione di ogni singolo sferoide stato stimato automaticamente da un CUStom-ha sviluppato programma MATLAB. 4 A passo disegno manuale è stato aggiunto per aiutare ad acquisire le sferoidi, che erano vicino al bordo in una data immagine. Almeno 8 sferoidi sono stati misurati per dose di trattamenti TSA in ogni punto. Il volume di ciascuna sferoide 3D ​​è stato calcolato come 0,5 x lunghezza x larghezza 2. Come visto in figura 3A e 3B, rispetto al veicolo, tutte le dosi di TSA mostrate nelle figure dimostrato un certo grado di inibizione della crescita di BON-1 sferoidi 3D. Tra questi, le concentrazioni di 125 nM e 250 nM di TSA fortemente soppressa la crescita di sferoidi 3D e portato alla morte cellulare a 96-ore punto temporale. Per comprendere l'istologia degli sferoidi NET 3D, uno H e E e immunoistochimica (IHC) sono stati eseguiti su sferoidi 3D che erano state coltivate per 17 giorni. Figura 4A illustra un metodo per elaborare sferoidi 3D per l'incorporamento HistoGel, che è la chiave passo per la paraffina del 3D spher OID. Figura 4B mostra la colorazione H & E, la colorazione immunoistochimica del clivata caspasi-3 (un marcatore per le cellule apoptotiche) e Ki-67 (un marcatore per le cellule proliferanti) anticorpi su sferoidi 3D, che erano state coltivate per 17 giorni . Le cellule all'interno del nucleo degli sferoidi 3D sono principalmente necrotica / apoptotico e le cellule dello strato esterno sono attivamente proliferanti. Figura 1. La morfologia di NET sferoidi 3D. Gli sferoidi 3D da tre linee cellulari tumorali umane neuroendocrini sono formate sulla agarosio rivestite piastre da 24 pozzetti. 1.000 cellule BON-1, H727 e QGP-1 sono state seminate su agarosio rivestite con piastre da 24 pozzetti e cresciuto in una condizione fisiologica come specificato nel protocollo. Queste sono le immagini di sferoidi 3D per BON-1 e H727 o aggregati di cellule QGP-1, che sono state coltivate per 10 giorni. 18/4218fig2.jpg "alt =" Figura 2 "/> Figura 2. Il monitoraggio della crescita dei BON-1 sferoidi 3D Il monitoraggio della crescita di Bon-1 sferoidi 3D:. Formazione, la crescita e la disgregazione di sferoidi 3D. Come specificato nel protocollo, 1.000 BON-1 cellule vengono piastrate su un agarosio rivestite con piastra da 24 pozzetti. Le cellule vengono coltivate in mezzo DMEM/F12 uno standard con 10% FBS in un agitatore orbitale in una condizione fisiologica notte, poi trasferito su una piattaforma stabile e coltivati ​​nelle stesse condizioni. La crescita delle cellule inseguimento in 3D sono state seguite da cellule di imaging ogni ora per le prime 5 ore dopo la placcatura, e quindi ogni 1-3 giorni con una Zeiss Axiovert 200/M-based microscopio a contrasto di fase usando un obiettivo 5x. Le cellule si aggregano in prime messe, poi formare aggregati multicellulari, sferoidi piccoli, grandi sferoidi, e alla fine gli sferoidi si disintegrano. Figura 3. Trattamento TSA il BON-1Sferoidi 3D. (A) Immagini di sferoidi 3D in seguito al trattamento TSA. Gruppo di trattamento: V – Vehicle (0,0025% DMSO); D1-dose 1 (15,625 nM TSA); D2-dose 2 (31,25 nM TSA); D3: dose 3 (62,5 nM TSA); D4: dose 4 (125 nM TSA ); D5: alla dose di 5 (250 nM TSA). Tempo di trattamento: 0 H – punto di tempo che i trattamenti iniziati il ​​giorno 6 sferoidi 3D, 24 H, 48 H, 72 H e 96 H sono i punti temporali dopo i trattamenti iniziato. Sferoidi 3D sono stati ripresi in ogni punto temporale come prima. (B) La crescita degli sferoidi 3D in seguito al trattamento TSA. I principali (L) e minore (W) assi dei sferoidi 3D in (A) sono stati stimati automaticamente dal programma Matlab ad ogni tempo di trattamento (0, 24, 48, 72 e 96 ore). Il volume degli sferoidi 3D è stato stimato in 0,5 L x W x 2. Il volume dello sferoide nel grafico è la media di 8 repliche e la barra di errore è stato calcolato sulla base di 8 repliche. Tabella 1.Disposizione dei trattamenti farmacologici su una piastra da 24 pozzetti Figura 4A. Illustrazione di un metodo per elaborare sferoidi 3D per Embedding HistoGel. Un metodo per elaborare sferoidi 3D per l'incorporamento HistoGel e la colorazione immunoistochimica degli sferoidi 3D (A) Una panoramica di un metodo per elaborare sferoidi 3D per l'incorporamento dei HistoGel. Sferoidi 3D sono stati incapsulati in un HistoGel essere allo stesso livello della cryomold biopsia, quindi il HistoGel / blocco sferoidi è stato avvolto in un blu Bio-avvolgimenti e trasferito in una cassetta per biopsia giallo paraffina. Figura 4B. H & E colorazione e colorazione immunoistochimica del giorno-17 sferoidi 3D. (B) colorazione H & E, colorazione immunoistochimica di Ki-67 e spaccati caspasi-3 degli sferoidi 3D di 17 giorni. Il paraffin incorporate diapositive sono stati sezionati deparaffinate e recupero dell'antigene è stata effettuata utilizzando CCI (Conditioning Solution Cell, Verana Medical System, # 711-065-152). Coniglio policlonale Ki-67 anticorpo (Abcam. # Ab833) e spaccati caspasi 3 anticorpo (Tecnologia di segnalazione cellulare, # 9661) sono stati applicati ad una concentrazione di 1:75 e 1:200, rispettivamente, per 1 ora a temperatura ambiente. L'anti-coniglio anticorpo secondario (Jackson Immunolab, # 711-065-152) è stato applicato a 1:500 per 1 ora a temperatura ambiente, seguito da rivelazione cromogenico kit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). I vetrini sono stati di contrasto con ematossilina e disidratato ed eliminato prima coprioggetto da xilene.