Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

1. Herstellung von 1% Agarose-beschichtete 24-Well Platte 1 g Agarose (RPI, A20090-500) auf 100 ml entionisiertem Wasser in einem 250 bis 500 ml-Flasche und Autoklaven sterilisieren, um die Agarose (121 ° C, 15 bar, 15 min im Autoklaven Maschine). Übertragen Sie die Flasche mit sterilisierten Agarose in ein 70 ° C warmes Wasserbad. Die Agarose ist bereit, gegossen, wenn es um 70 ° C, die etwa eine Stunde dauert gekühlt wird werden. Vergewissern Sie sich, um die Agarose steril zu allen Zeiten zu halten. Besorgen Sie sich die 24-Loch-Flachboden-Platten (Falcon, 353047), jede Art der 24-Loch-Flachboden-Platten funktionieren würde, wenn die Platten unter einem Phasenkontrast-Mikroskop abgebildet werden können. Geben Sie 200 ul Agarose in jede Vertiefung mit einer Eppendorf-Pipette Repeater in einer biologischen Sicherheitswerkbank und wirbeln die Agarose um den Brunnen zu machen, die auch gleichmäßig bedecken. 200 ul Agarose ist angebracht, eine konkave Oberfläche bilden, so dass die konsequente Sphäroide kugelige Formen bilden können. Weniger als 200 ul Agarose kann nichtdecken die auch ganz, aber mehr als 200 ul Agarose nicht bilden die konkave Oberfläche und die Sphäroide darauf gewachsenen nicht zu sphärischen Formen. Die Agarose-beschichtete 24-Well-Platten werden, aber in etwa 10 min verwendet werden. (Optional) Geben Sie 100 ul Medium, um die Agarose mit Kulturmedium vor der Aussaat Zellen ausgleichen. Alternativ kann nach der Agarose vollständig erstarrt ist, werden 100 ul Wachstumsmedium in jede Vertiefung und dichten die Platten mit dem sterilen Dichtband (Nunc, 236366). Diese Platten können bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden. 2. Vorbereitung der Einzelzell-Suspensionen Alle Experimente werden durchgeführt unter Verwendung der üblichen aseptischen Techniken in einer biologischen Sicherheitswerkbank und alle Kulturen sind in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in Luft gewachsen, wenn nicht anders angegeben. Menschlichen Pankreas-NET BON-1-Zellen werden in DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, gehalten Invitrogen,16000-044) Medium in einem 100 mm x 20 mm steril Gewebekulturschale (Corning, 430.167). Wenn Monoschicht BON-1-Zellen 70-80% Konfluenz erreichen, wird das Medium entfernt. Die Zellen werden mit PBS zweimal gewaschen und vertrieben von der Schale durch Zugabe von 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) mit 5 min Inkubation bei 37 ° C TrypLE ähnelt, aber Trypsin bei 15 stabil – 30 ° C sowie bei 4 ° C Prüfen Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, werden alle Zellen von der Schale gelöst werden. In 9 ml Wachstumsmedium auf die Zellen trypsiniert und mit einer Pipette, um Zellen und Abpipettieren ein paar Mal, um eine noch einzelne Zellsuspension zu gewährleisten. Verwenden 70 um Zellsieb (Fisher, 22.363.548), um die Zellen zu filtern. Sammle Zellen und führen Sie eine Zellzahl mit Guava PCA-96 Base System (Millipore). Eine Suspension von 5.000 Zellen pro ml in phenol-DMEM/F12 mit 10% FBS Wachstumsmedium. 3. Spheroid Kultur Overlay 200 ul der einzelnenZellsuspensionen auf der Agarose-beschichteten 24-Well-Platte und dichten die 24-Well-Platten mit der sterilen Dichtband um Verdunstung zu verhindern. Hinweis: – Die Anzahl der Zellen zu plattierenden ist empirisch basierend auf der Größe der Kügelchen am Tag 6 bestimmt werden; 300-400 Mikrometer Durchmesser der Kügelchen wäre die ideale Größe für den Start der medikamentösen Behandlung sein, 1000 BON-1 und H727-Zellen werden ausplattiert. – Wir raten ab medikamentöse Behandlungen nach Tag 6, weil die Lebensfähigkeit der Zellen 3D beginnt ab ca. Tag 10 (Daten nicht gezeigt, Manuskript in Vorbereitung) fallen zu lassen. Platzieren Sie die oben Agarose-beschichtete 24-Well-Platten mit BON-1-Zellen auf einem Schüttler mit einer sehr langsamen Rühren von weniger als 40 Umdrehungen pro Minute über Nacht in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in Luft. Dann bewegen Sie diese Platten auf einer stabilen Plattform zu halten, die Kulturen wachsen. Geben Sie 200 ul Wachstumsmedium in jede Vertiefung der Platte obens alle 3 Tage. Bitte nicht stören die Sphäroide. Versuchen Sie, Medium durch die Wand jeder Vertiefung hinzufügen, indem Sie die Pipettenspitze auf der Seite des gut und lassen den Durchfluss des Mediums in den Brunnen hinab. Überwachen Sie die Sphäroid-Bildung in den 24-Well-Platten unter dem Mikroskop. 4. Medikamentöse Behandlung Wenn die Sphäroide rund 300-400 um Durchmesser am Tag 6 erreichen, werden die 3D-Sphäroiden mit Medikamenten behandelt. Dies wird als Tag 0 für medikamentöse Behandlung bezeichnet. An Tag 6 enthält jede Vertiefung der Platte ca. 400 ul Medium. Um sicherzustellen, dass die medikamentösen Behandlungen sind bei 1x Endkonzentration in jede Vertiefung, 3x serielle Verdünnungen von jeder Gabe von Behandlungen werden von der Droge Lager in 5 ml Wachstumsmedium in einer 15 ml konischen Röhrchen, das ist genug für 8 Wiederholungen gemacht. Die Sphäroide in jeder Zeile der 24-Well-Platte werden als Vehikel, Dosis 1, 2, 3, 4 und 5 kategorisiert. Es gibt 4 Wiederholungen für jede Dosis von Behandlungen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen (siehe <strong> Tabelle 1). Wir Regel behandeln 3D Sphäroide bei mindestens 2 Platten mit 24 Vertiefungen, wodurch mindestens 8 Wiederholungen für jede Dosis von Behandlungen. Drehen Sie den 24-Well-Platte bei 800 rpm für 5 min bei 4 ° C, um sicherzustellen, dass alle Verdichtungen auf der Dichtband in den Brunnen zu gehen. Aufgrund der schwimmenden Merkmal der 3D Sphäroide, wird das Medium in jeder Vertiefung nicht entfernt, um die Störung der Sphäroide zu vermeiden. Vorsichtig 200 ul der oben maßgeschneiderte Behandlungen jeder Dosis in die entsprechenden Vertiefungen an der Wand entlang eines jeden gut. Versiegeln Sie die 24-Well-Platten mit dem Dichtband und inkubieren Sie die Kulturen in der 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in Luft. Bei Bedarf zurückziehen, die Sphäroide in jede Vertiefung mit der jeweiligen Dosis von Behandlungen nach 72-96 Std. 5. 3D-Monitor Spheroid Kulturen Bei jedem gewählten Zeitpunkt nach Behandlungen (0, 24, 48, 72 h), die Sphäroide in jede Vertiefung ter 24-Well-Platte werden mit einem Zeiss Axiovert 200/M-based Phasenkontrast-Mikroskop mit einem 5fach Objektiv abgebildet. Hinweis: Bilder können auf jedem Lichtmikroskop mit einem kalibrierten Skalierung zwischen um-und Pixel-genommen werden. Ein 5fach Objektiv ist ideal, weil die Sphäroide schnell herauswachsen den Imaging-Bereich mit einem 10-fach Objektiv. Spheroid Analyse kann manuell durchgeführt werden mit Zeiss AxioVision 4.8.2 Software mit den RAW-Bildern. Alternativ wird eine kundenspezifisch entwickelte MATLAB-Programm verwendet werden, um die Größe der Sphäroide automatisch / halbautomatisch zu schätzen. Das Automatik-Programm implementiert die aktive Konturalgorithmus 4 bis genau zu lokalisieren Kontur der Sphäroid in einem gegebenen Bild und messen ihre großen (L) und Minor (W) Achsen automatisch. Eine halbautomatische Version des gleichen Algorithmus erlaubt es Benutzern zu helfen, das Programm zu initiieren, wenn starke Artefakt vorhanden ist. Alle Bilder müssen als TIFF-oder JPEG-Dateiformate aus exportiert werdenDie RAW-Bilder in das Programm eingelesen werden. Das Volumen des Sphäroid ist als 0,5 x L x W 2 geschätzt. 6. HistoGel-Einbettung der 3D-NET Sphäroide 10-24 Sphäroide aus den 24-Well-Platten gesammelt, zweimal in PBS gewaschen, in 10% Formalin für 2 Stunden fixiert, gewaschen mit 50% und 70% Ethanol zweimal für 15 min, jeweils, und sind für HistoGel Einbettung bereit. Alternativ können sie in 70% Ethanol bei 4 ° C werden für mehrere Monate aufbewahrt. Eine Röhre von kalten HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) wird in einem Becherglas mit Wasser gefüllt stellen. Das Becherglas wird in einer Mikrowelle für 1 Minute erhitzt, bis das Gel oder vollständig verflüssigt wird, dann in der gleichen Wasser gefüllten Becher zu allen Zeiten gehalten. Die Sphäroide in 70% Ethanol von oben in eine Biopsie cryomold (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) mit einem Zahnstocher übertragen. Achten Sie darauf, alle Sphäroiden übertragen werden. Lassen Sie die Sphäroide sitzen für eine Minute zu sinken bis auf den Boden der Biopsy cryomold. Versuchen Sie, loszuwerden, die Flüssigkeiten in der Biopsie cryomold mit Kimwipes und inzwischen sehr vorsichtig in das Sphäroide in die Mitte am unteren Rand der Biopsie cryomold mit der Einweg-Kunststoff-Pasteurpipette. Dieser Schritt kann leichter unter einem Präpariermikroskop durchgeführt werden. Eine dünne Schicht von erwärmtem HistoGel auf der Biopsie cryomold hinzugefügt, um die Sphäroide am unteren Ende der Biopsie cryomold stabilisieren, das inzwischen Zahnstocher wird verwendet, um die Sphäroide in der Mitte an der Unterseite der Biopsie cryomold sehr sanft zu halten. Sie nicht zu viel HistoGel aber gerade genug zur Stabilisierung der Sphäroide im unteren Bereich der Biopsie cryomold. Lassen Sie die Sphäroide / HistoGel sitzen für 1-2 min bei Raumtemperatur oder bis der HistoGel verfestigt wird. Dann füllen Sie den Rest der Biopsie cryomold mit der erwärmten HistoGel. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für ca. 10 min zu verfestigen. Kurz vor dem Herausspringen der Sphäroide / HistoGel Block von der Biopsie cryomold, leave bei 4 ° C für 1 min, was Herausspringen der intakten Sphäroide / HistoGel Block hilft. Die Sphäroide / HistoGel Block wird dann in einem Stück Bio-Wraps (Surgipath, 01090) gewickelt und in ein Gewebe und Biopsie-Kassette (Fisher Scientific, 15 bis 182-701d). Das Gewebe und Biopsie Kassette in einem Behälter mit 70% Ethanol gelagert. Dann geht die Routine Gewebe Verarbeitungsverfahren für Paraffineinbettung befolgt werden. 5 Das Paraffin-Block kann im Schnitt in 3-um dicke Schicht Dias. Die Folien können mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt werden, um histologische Veränderungen bestimmen und kann auch für immunhistochemische Färbung verwendet werden. 7. Repräsentative Ergebnisse Die menschliche pankreatische neuroendokrine Tumor-Zelllinien BON-1 (zur Verfügung gestellt, um Verto Institut von Kjell Oberg, Universität Uppsala, Schweden), QGP-1 (japanische Health Sciences Foundation, Osaka, Japan), und die menschliche Lunge neuroendokrinen Tumor-Zelllinie H727 (ATCC) wurden gewachsen auf einem agarosE-beschichtete 24-Well-Platte. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, zeigen die drei Zelllinien unterschiedlicher Morphologie. BON-1 und H727 Zellen gebildet 3D Sphäroide. Unter dem Mikroskop zeigte H727 Zellen dichter und kompakter als Sphäroide BON-1-Zellen. Wir vermuten, dass H727-Zellen eine erhöhte Fähigkeit zur Zell-Zell-Adhäsion haben und bilden engere Verbindungen als Ergebnis. QGP-1-Zellen zeigen eine große Trauben, poröse Massen, die nicht als Kugeln betrachtet werden. Aufgrund der steigenden Interesse neuroendokriner Tumor Forschung in den letzten Jahren sind BON-1-Zellen für den Rest der Figuren verwendet. Nach dem Impfen BON-1-Zellen auf die Agarose-beschichteten 24-Well-Platte, mehrzellige Sphäroide Bildung erfolgt typischerweise durch die 3. oder 4. Tag und die Sphäroide runder geworden durch die 6. Tag. Aufgrund der Nährstoffe und Sauerstoff Einschränkung Zellen in der dichten Kern der Sphäroide um Tag 10 und am Tag 17 sterben zu starten, beginnt die Sphäroide auf Grund der Größe oder zerfallen, somich Fällen den Auswurf des nekrotischen Kern. Die Sphäroide in der Regel können bis zu 1.000 m im Durchmesser. Abbildung 2 zeigt die Bereiche der Bildung, Wachstum und Zerfall von BON-1 3D Sphäroide. Drug Behandlungen wurden gestartet, wenn Sphäroide waren rund 300 bis 400 mu m und Zellen zurückgehalten hohe Rentabilität (Manuskript in Vorbereitung). Tag 6 3D Sphäroide wurden als Startpunkt für medikamentöse Behandlungen gewählt. Es wurde berichtet, dass Histondeacetylaseinhibitoren antiproliferativen und proapoptotischen Effekte auf die NET-Zellen zeigten. 6 Wir haben uns für die Histon-Deacetylase-Inhibitor-Trichostatin A (TSA) als ein Beispiel, um die Wirkung der medikamentösen Therapie auf 3D-NET Sphäroide zu illustrieren. 3A zeigt die Morphologie der 3D Sphäroide auf die Behandlung von TSA. 3B zeigt das Volumen der 3D Sphäroide nach TSA (Sigma, T8552) Behandlung. Die Größe der einzelnen Sphäroids wurde automatisch von einem Kunden geschätztMATLAB Computerprogramm tom entwickelt. 4 A Handzeichnung Schritt zugegeben, um bei dem Erwerb der Sphäroide, die nahe an den Rand in einem gegebenen Bild waren. Mindestens 8 Sphäroide wurden pro Dosis der TSA-Behandlungen zu jedem Zeitpunkt gemessen. Das Volumen jeder 3D-Sphäroid wurde als 0,5 x Länge x Breite 2 berechnet. Wie in 3A und 3B, im Verhältnis zum Fahrzeug gesehen, zeigten alle Dosen von TSA in den Figuren gezeigt, einen gewissen Grad der Wachstumshemmung von BON-1 3D Sphäroide. Unter diesen sind die Konzentrationen von 125 nM und 250 nM TSA stark unterdrückt das Wachstum von 3D Sphäroide und führte zu Zelltod bei 96-Stunden-Zeitpunkt. Um die Histologie der NET 3D Sphäroide zu verstehen, ein H & E und immunhistochemischen (IHC) Färbung wurden auf 3D Sphäroide, die für 17 Tage kultiviert worden waren durchgeführt. 4A veranschaulicht ein Verfahren zur 3D-Sphäroiden für HistoGel Einbettung zu verarbeiten, das ist der Schlüssel Schritt für Paraffin-Einbettung von 3D Kugelgraphit OIDs. 4B zeigt die H & E-Färbung, die immunhistochemische Färbung der Caspase-3 (ein Marker für apoptotische Zellen) und Ki-67 (ein Marker für proliferierende Zellen) Antikörper auf 3D Sphäroide, die für 17 Tage gezüchtet worden waren, . Die Zellen innerhalb des Kerns der 3D Sphäroide sind meist nekrotischen / apoptotischen und die äußere Schicht Zellen aktiv vermehren. Abbildung 1. Die Morphologie des NET 3D Sphäroide. Die 3D Sphäroide aus drei humanen neuroendokrinen Tumor-Zelllinien werden auf Agarose-beschichtete 24-Well-Platten ausgebildet sind. 1000 BON-1, H727 und QGP-1-Zellen wurden auf Agarose-beschichtete 24-Well-Platten angeimpft und in einem normalen physiologischen Zustand, wie in dem Protokoll. Dies sind die Bilder von 3D Sphäroide für BON-1 und H727 oder Zellaggregate für QGP-1, die für 10 Tage kultiviert wurden. 18/4218fig2.jpg "alt =" Bild 2 "/> Abbildung 2. Der Growth-Tracking von BON-1 3D Sphäroide Das Wachstum Verfolgung von BON-1 3D Sphäroiden:. Bildung, Wachstum und Zerfall von 3D-Sphäroiden. Wie im Protokoll detailliert, werden 1.000 BON-1-Zellen auf ein Agarose-beschichtete 24-Well-Platte ausplattiert. Die Zellen in einem Standard-DMEM/F12-Medium sind mit 10% FBS auf einem Schüttler in einem physiologischen Zustand über Nacht gewachsen, zog dann auf einer stabilen Plattform gewachsen und im gleichen Zustand. Das Wachstum der 3D-Tracking-Zellen wurden durch bildgebende Zellen jede Stunde für die ersten 5 Stunden nach dem Ausstreichen gefolgt, und dann alle 1-3 Tage mit einem Zeiss Axiovert 200/M-based Phasenkontrast-Mikroskop mit einem 5fach Objektiv. Die Zellen lagern sich zu Massen zuerst, dann bilden mehrzellige Aggregate, kleine Kügelchen, Sphäroiden größer, und schließlich die Sphäroide zerfallen. Abbildung 3. TSA-Behandlung auf BON-13D Sphäroide. (A) Bilder von 3D-Sphäroiden auf TSA-Behandlung. Behandlungsgruppe: V – Fahrzeug (0,0025% DMSO); D1-Dosis von 1 (15,625 nM TSA); D2-Dosis 2 (31,25 nM TSA); D3: Dosis 3 (62,5 nM TSA); D4: Dosis 4 (125 nM TSA ); D5: Dosis 5 (250 nM TSA). Zeitpunkt der Behandlung: 0 H – Zeit Punkt, dass Behandlungen am Tag 6 3D Sphäroide gestartet, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h sind die Zeitpunkte, nachdem die Behandlung begonnen. 3D Sphäroide wurden zu jedem Zeitpunkt als bisher dargestellt. (B) Das Wachstum der 3D-Sphäroiden auf TSA-Behandlung. Die großen (L) und kleinere (W) Achsen der 3D Sphäroiden in (A) wurden automatisch durch Matlab Programm zu jedem Zeitpunkt der Behandlung (0, 24, 48, 72 und 96 Stunden) geschätzt. Das Volumen der 3D Sphäroide wurde als 0,5 x L x W 2 geschätzt. Das Volumen des Sphäroids im Diagramm war der Durchschnitt von 8 Replikaten und die Fehlerbalken wurde auf der Basis 8 Replikaten berechnet. Tabelle 1.Anordnung der medikamentösen Behandlungen auf einer 24-Well-Platte 4A. Darstellung eines Verfahrens zur 3D Sphäroide für HistoGel Verankerungsprozess. Ein Verfahren zur 3D-Sphäroiden für HistoGel Einbettung und immunhistochemische Färbung der 3D-Sphäroiden (A) Ein Überblick über eine Methode, um 3D-Sphäroiden für HistoGel Einbettung zu verarbeiten. 3D Sphäroide wurden in einem HistoGel eingekapselt werden, um auf dem gleichen Niveau in der Biopsie cryomold, dann wird die HistoGel / Sphäroide Block wurde in einem blauen Bio-Packungen verpackt und in einen gelben Biopsie Kassette für Paraffineinbettung sein. 4B. H & E Färbung und immunhistochemischen Färbung von Tag-17 3D Sphäroide. (B) H & E Färbung, Immunhistochemische Färbung von Ki-67 und Caspase-3 der 17-tägigen 3D Sphäroide. Die paraffin-embedded geschnittene Folien waren entparaffinierten und Antigen-Retrieval wurde mit CCI (Cell Conditioning Solution, Verana Medical System, # 711-065-152). Polyklonaler Kaninchen-Antikörper Ki-67 (# Abcam. Ab833) und Caspase 3-Antikörper (Cell Signaling Technology, # 9661) wurden bei einer Konzentration von 1:75 und 1:200 angelegt werden, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Jackson Immunolab, # 711-065-152) wurde bei 1:500 für 1 Stunde bei Raumtemperatur aufgebracht, gefolgt von chromogenen Nachweis-Kit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und dehydrierte und gelöscht werden, bevor Eindecken aus Xylol.