人类神经内分泌肿瘤细胞株为研究人类神经内分泌肿瘤治疗的三维模型

1。制备1％琼脂糖涂层的24孔板 1 G琼脂糖（RPI的，A20090-500）加入去离子水100毫升，在250-500毫升瓶和高压消毒的琼脂糖（121℃，15磅，15分钟高压灭菌机）。转入70℃水浴瓶消毒琼脂糖。琼脂糖是随时可以倒，当它冷却到70°C，这需要一个小时左右。确保琼脂糖无菌时刻保持。 获得24平底板（猎鹰，353047），任何一种24孔平底板，将工作，如果该板块可以根据相衬显微镜成像。 在生物安全柜和漩涡周围以及琼脂糖使其覆盖的良好均匀的Eppendorf中继吸管，每孔200μL琼脂糖免除。 200μL琼脂糖是适当的，以形成凹面，使球体能形成一致的球形。不得小于200μl琼脂糖以及完全覆盖，但超过200μl琼脂糖可能不会形成凹面和它生长的球体，可能无法形成球形的形状。 琼脂糖涂层的24孔板在使用约10分钟准备。 （可选）介质平衡琼脂糖前种子细胞培养基中加入100μL。 此外，琼脂糖完全凝固后，加入100μL培养基中，每孔和密封无菌密封胶带（NUNC，236366）板块。长达一个星期，这些板块可以储存在4°C。 2。单细胞悬浮液的制备所有的实验都使用了标准的无菌技术在生物安全柜和所有的文化都生长在37℃培养箱孵化，5％CO 2在空气中，除另有指明。 NET BON-1人胰腺癌细胞维持在含10％胎牛血清（FBS，Invitrogen公司的DMEM/F12（Invitrogen公司，10565），16000-044）在100毫米的中等×20毫米无菌组织培养皿（康宁，430167）。 当单层BON-1细胞达到70-80％汇合，中被删除。细胞用PBS洗两次，从盘脱落增加5分钟孵育1毫升TrypLE（Invitrogen公司，12604）在37°C TrypLE类似胰蛋白酶，但稳定在15 – 30°C以及在4°C。显微镜下检查，以确保所有的细胞都从盘脱节。 9毫升培养基中加入胰酶消化细胞，用吸管吸取细胞上下几次，以确保即使是单细胞悬液。 使用70微米的细胞过滤器（费舍尔，22363548）筛选细胞。 收集细胞，进行细胞计数，用番石榴PCA-96相应的系统（Millipore公司）。 准备苯酚的DMEM/F12 10％FBS的培养基中的每毫升5000细胞的悬浮液。 3。球体文化覆盖200μL单细胞悬浮液的琼脂糖涂层的24孔板和24孔板密封无菌的密封胶带，以防止蒸发。 注： – 镀细胞的数量应根据经验来确定的基础上，在6天的球体的大小; 300-400微米直径的球体将开始药物治疗的理想规模1000 BON-1和; H727细胞接种。 – 我们不建议开始药物治疗后第6天，因为三维细胞的活力开始下降，约10天（数据未显示，在准备稿件）。 将上述琼脂糖涂层的24孔板上的轨道摇床苯教-1细胞在5％CO 2在空气中过夜，在37℃培养箱孵化低于40 RPM非常缓慢的搅拌。然后将这些板块一个稳定的平台，以保持不断增长的文化。 加入200μl的生长介质以及上述板块的每个的每3天。请勿打扰的球体。通过触摸枪头一侧以及让中等入井流了下来，尝试通过每口井的墙壁添加介质。 在显微镜下，在24孔板监察球体形成。 4。药物治疗当球体达到约300-400微米，直径在6天，3D球体药物治疗。这是记为0天的药物治疗。 在第6天，每板以及包含大约400μL培养基。为了确保1X终浓度为每口井，每个治疗剂量的3倍系列稀释的药物治疗，从药物库存在5毫升15毫升锥形管，这是8足够的复制生长介质。 在24孔板的每一行的球体被归类为汽车，剂量1，2，3，4及5。有4个重复治疗的剂量为每一个24孔板（见<stroNG>表1）。我们通常把3D球体，至少在2月24孔板，这使得至少有8个，每个治疗剂量复制。 降速为5分钟800转的24孔板，在4°C至确保所有封箱胶带凝聚入井。由于浮动的3D球体的功能，在每口井的介质不会被删除，以避免干扰的球体。 仔细地添加到适当的井每口井的墙沿200μL上述各剂量国产治疗。 封箱胶带密封24孔板和培育的文化，在37°C间湿润的孵化器与空气中的5％CO 2。 如果有必要，撤退在各自的剂量与治疗后72-96小时，每口井的球体。 5。显示器3D球体文化在选择药物治疗后，每个时间点（0，24，48，72小时），球体在每个井的T他24孔板成像与蔡司Axiovert 200/M-based的相衬显微镜使用5倍的目标。 注：图片可以采取任何光学显微镜校准与微米和像素之间的尺度。 5倍的目标是理想的，因为球体迅速长大成像领域与10倍的目标。 球体的分析，可以进行手动蔡司AxioVision 4.8.2软件使用原始图像。 此外，定制开发的MATLAB程序用于估计球体的大小，自动/半自动自动。自动程序实现了主动轮廓算法准确定位在一个给定的图像球体的轮廓，并测量其主要（L）和未成年人（宽）轴自动。一个相同的算法的半自动版本，允许用户启动程序时，强大的神器存在。所有的图像必须为TIFF或JPEG文件格式导出程序读取原始图像。球体的体积估计为0.5 x长x宽2。 6。 NET 3D球体HistoGel嵌入 10-24球体收集从24孔板，PBS洗涤两次，在2小时10％福尔马林固定，洗净，在50％和70％乙醇15分钟两次，分别是准备HistoGel嵌入。此外，他们可以保持在4°C，70％的乙醇在几个月。 管冷HistoGel（Thermo Scientific的，HG-4000-012）在装满水的烧杯中。在1分钟微波加热烧杯直到凝胶完全液化，然后保留在任何时候都在同一个装满水的烧杯。 转入活检的cryomold（组织TEK，4565樱花Finetek），用牙签在70％以上的乙醇的球体。确保所有的球体被转移。让球体坐在一分钟下沉至底部的生物PSY cryomold。尝试得到摆脱活检cryomold的液体与Kimwipes同时，非常轻轻推球体中心使用一次性塑料巴斯德吸管在的活检cryomold的底部。要在解剖显微镜下进行，这一步可能会更容易。 一层薄薄一个温暖HistoGel的添加到活检cryomold来稳定在活检cryomold底部的球体;同时，牙签是用来保持在球体中心在活检cryomold底部非常轻柔的。不添加太多HistoGel，但刚好够稳定在活检cryomold底部的球体。 让球体/ HistoGel的坐在在室温或，直到HistoGel凝固1-2分钟。然后填写与温暖HistoGel的活检cryomold休息。 允许它在室温下固化，约10分钟。 只是前弹出球体/ HistoGel块活检cryomold，LEA在4°C，1分钟，这有助于完整球体/ HistoGel的块弹出了VE的。球体/ HistoGel块，然后包裹在一块的生物套（Surgipath，01090）和组织的投入和活检卡带（Fisher Scientific则15-182-701D）。组织活检磁带存储在用70％乙醇的容器。然后常规石蜡包埋组织处理程序。 石蜡块切片到3微米厚层幻灯片。幻灯片可以与苏木精伊红染色，以确定病理改变，也可用于免疫组化染色。 7。代表结果人体胰腺神经内分泌肿瘤细胞株BON-1（由瑞典乌普萨拉大学的谢尔·奥伯格，Verto研究所提供），QGP物质-1（日本健康科学基金会，大阪，日本），人肺神经内分泌肿瘤细胞系H727（ATCC）种植1琼脂糖E-涂层的24孔板。在图1可以看出，这三个细胞株显示出不同的形态。 BON-1和H727细胞形成三维的球体。在显微镜下，H727细胞显示比BON-1细胞的球体更紧密和更紧凑的。我们推测，H727细胞增加细胞与细胞粘附能力，并因此形成更紧密的路口。 QGP物质-1细胞显示大葡萄状多孔的群众，这是不作为球体。由于胰腺神经内分泌肿瘤研究近年来的兴趣上升，BON-1细胞用于其余的数字。雍慧阁-1细胞在琼脂糖涂层的24孔板播种后，形成多细胞球体，通常会出现3 路或4 天的第 6天的球体成为全才。由于养分和氧气的限制，在致密的球体核心的细胞开始死亡，约10天，17日，球体开始瓦解，由于大尺寸或在如此我的情况下弹射坏死核心。通常的球体可以长大到直径1000微米。 图2显示BON-1三维球体的形成，生长和解体的部分。 药物治疗开始时，球体保留约300-400微米和细胞存活率高（准备稿）。 6日3D球体被选中作为药物治疗的起点。据报道，组蛋白去乙酰酶抑制剂表明对NET细胞增殖和凋亡的影响。6，我们选择了一个（TSA）作为一个例子来说明药物治疗的三维网状球体的效果。 图3A显示了组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌治疗后，TSA的。 图3B，3D球体的形态显示TSA（Sigma公司，T8552）治疗后的3D球体的体积。估计每一个人球体的大小自动通过CUS汤姆开发的MATLAB计算机程序。增加了4手工绘图步骤，以帮助收购的球体，这是在给定的图像边缘。在每个时间点至少有8个球体被测定，每剂量的TSA处理。每个3D球体的体积为0.5 x长x宽2计算。在图3A和3B，相对车辆，所有的数字显示TSA的剂量表现出某种程度的生长抑制BON-1三维球体。其中，125纳米和250纳米TSA的浓度强烈抑制3D球体的生长，导致细胞的死亡在96小时的时间点。 理解NET 3D球体的组织学，，H＆E和免疫组化（IHC）染色进行三维球体，已培养了17天。 图4A显示了一个方法来处理为HistoGel嵌入3D球体，这是关键三维球状石蜡包埋的一步 OIDS。 图4B H＆E染色，裂解的caspase-3（细胞凋亡的标志）和Ki-67免疫组织化学染色（增殖细胞标记）3D球体上的抗体，这已培养了17天。内核心的3D球体的细胞大部分坏死/凋亡和外层细胞积极增殖。 图1。 NET 3D球体形态。从三个人类神经内分泌肿瘤细胞株的3D球体上形成琼脂糖涂层的24孔板。 1000 BON-1，H727和QGP的-1细胞接种到24孔板琼脂糖涂层，在正常生理条件下生长，在协议中详细。这些都是QGP的1 BON-1和H727或细胞聚集，培养10天的3D球体的图像。 18/4218fig2.jpg“ALT =”图2“/> 图2。 BON-1三维球体的生长跟踪苯教-1三维球体的生长追踪：三维球体的形成，生长和解体。在详细的协议，1000 BON-1细胞接种到24孔板琼脂糖涂层。细胞生长在一个标准的DMEM/F12培养基，10％胎牛血清对轨道振动筛在生理条件下过夜，然后搬到一个稳定的平台上，并在同等条件下种植。电镀后的前5小时，每隔一小时由成像细胞的三维细胞生长跟踪随访，然后每隔1-3天用蔡司Axiovert 200/M-based相衬显微镜使用5倍的目标。首先把群众聚集的细胞，然后形成多细胞的集合体，小的球体，球体大，最终球体瓦解。 图3。 BON-1 TSA处理3D球体。（一）3D球体TSA处理后的图像。治疗组：五 – 汽车（0.0025％二甲基亚砜），D1-1（15.​​625纳米TSA）的剂量，D2-2剂量（31.25 NM TSA）的，D3：3（62.5 NM TSA）的剂量，D4：4剂量（125纳米技术协议）; D5：剂量（250纳米，TSA）5。治疗时间：0小 – 时间点6天3D球体开始治疗24小时，48小时，72 h和96 h时间点，治疗开始后。 3D球体影像像以前那样在每个时间点。 （二）TSA处理后的3D球体的生长。主要（L）和小型（宽）在（A）的3D球体的轴，估计Matlab程序自动在每次治疗的时间点（0，24，48，72和96小时）。三维球体的体积估计为0.5 x长x宽2。在图球体的体积平均8复制和计算错误栏8复制基地。 表1。布局24孔板上的药物治疗 图4A。插图的方法处理为HistoGel嵌入的3D球体。3D球体（一）3D球体处理为HistoGel嵌入方法概述HistoGel嵌入和免疫组化染色的方法来处理3D球体。 3D球体，封装在HistoGel中，在相同的在活检cryomold的水平，然后HistoGel /球体块被包裹在一个蓝色的生物套转移到活检石蜡包埋黄色录像带。 图4B。 H＆E染色和免疫组化染色17日3D球体（B）H＆E染色，免疫组化染色，Ki-67和劈开的为期17天的3D球体Caspase-3的。在Paraffin嵌入式切片幻灯片脱蜡和抗原检索使用CCI（Verana细胞空调解决方案，医疗系统，＃711-065-152）。多克隆Ki-67的抗体（Abcam.＃Ab833）和cleaved caspase 3的抗体（细胞信号技术，＃9661）在1:75和1:200的浓度，分别在室温下为1小时。应用抗兔二抗（杰克逊Immunolab，＃711-065-152）在1:500为1小时，在室温下，发色检测试剂盒DABMap（Ventana公司医疗系统，＃760-124）。幻灯片与苏木和脱水counterstained和前盖片从二甲苯清除。