의 세포 구체적인 분석<em> Arabidopsis</em> 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎
概要
생산하기위한 방법<em> Arabidopsis</em> 특정 세포 집단의 연구에 대한 허용, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)와 호환되는 잎 protoplasts. 이 방법은 어떤과 호환됩니다<em> Arabidopsis</em세포의 일부에서 GFP를 표현> 줄입니다.
Abstract
잎 primordium의 개시 후, 바이오 매스 축적은 주로 세포 증식과 잎 1 확장에 의해 제어됩니다. 그러나, Arabidopsis 잎은 다양한 세포 유형과 여러 구조로 구성 복잡한 기관이다. 동시에 성장하는 잎은 확장을 중단하고 노화 1 받아야 할 첫 번째되는 잎자루에서 먼 세포로, 개발의 여러 단계에서 세포를 포함하고 있습니다. 잎 내의 다른 세포는 따라서 나누어 elongating 또는 구별되며, 적극적인 스트레스 나 죽어, 및 / 또는 한 번에 자신의 세포 유형의 하위 세트의 자극에 반응. 이것은 잎 도전의 게놈 연구를합니다 : 예를 들어 서로 다른 세포 반응 영역 또는 셀 유형에서 작동 유전자 네트워크에서 전체 잎, 신호의 표현 데이터를 분석 할 때 실마리를 못 찾고됩니다 생성 된 부정확 한 프로필에서 결과.
이 문제를 해결하려면, Several 방법은 세포 특정 유전자 발현 연구를 활성화하는 설명되어 있습니다. 이러한 레이저 캡처 microdissection (LCM) 2 또는 원형질 생성 및 후속 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 3,4, 핵 강수량 5 polysomes 6 immunoprecipitation의 최근 설명 그대로 시스템에 사용되는 GFP 표현 식물이 포함되어 있습니다.
FACS이 성공적으로 루트 팁에서 셀 정체성과 거리가 유전자 3,7 다수의 표현의 프로필에 큰 효과가 있다는 표시 등의 연구 숫자에 사용되었습니다. GFP 라인의 FACS는 루트 질소 반응 및 측면 루트 개발 8, 소금 스트레스 루트 10 9 옥신 분포 동안 세포 특정 전사 조절을 설명하고 Arabidopsis 촬영 꼭대기 분열 조직 (11)의 유전자 발현지도를 생성하는 데 사용되었습니다. 이기는하지만FACS는 이전에 autofluorescence 12,13에 따라 Arabidopsis 잎 파생 protoplasts을 정렬하는 데 사용되었습니다 잎에 GFP를 표현 Arabidopsis 줄에 FACS의 지금까지 사용 4 매우 제한된있다. 다음과 같은 프로토콜에서 우리는 원형질 생성 정권의 영향을 최소화하면서 FACS와 호환되는 Arabidopsis 잎 protoplasts를 획득하는 방법을 설명합니다. 우리는 혈관 조직 14 TP382 Arabidopsis 라인에 명시 GFP는 두 GFP를 표현 adaxial 표피 14 KC274 라인에 명시 GFP가의 핵 지방화 신호에 연결된 개념 KC464 Arabidopsis 라인을 사용하는 방법을 보여줍니다 경비 세포 (데이터 표시되지 않습니다, 그림 2). 현재 노화의 여러 단계에서 두 세포 유형의 개발과 스트레스 기간 동안 특정 표현뿐만 아니라 이기종 셀 인구를 공부하기 위해이 방법을 사용하는.
Protocol
Discussion
우리는 원형질 생성 및 FACS를 사용하여 후속 셀 정렬의 잎에 GFP를 표현 Arabidopsis 식물의 사용을 허용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 qPCR 또는 microarray에 의해 증폭, 따라서 이후의 분석에 사용되는 RNA의 충분한 양을 산출. 정렬 분수가 높은 등의 qPCR (그림 2)에 의해 증명 GFP 함유 세포에 풍부합니다.
잎 스트립 억제제가 함유 원형질 솔루션으로 침투 진공 될 때까지 라이브 protoplasts의 높은 수율을 달성하려면이 프로 시저의 초기 단계에서 신속하게 작동하는 것이 중요합니다. 또한, 1mm의 잎 스트립을 생성 할 때이 과도한 손상되므로 낮은 원형질 수율로 연결로, 잎보다는 '고기'또는 매시업을 갈라하거나 잘라서하는 것이 매우 중요합니다.
방법 사이의 중요한 차이는 여기와 다른 publishe 설명D 방법은 RNase 억제제와 전사 억제제를 사용하는 것입니다. 대부분의 방법은 protoplasts이 더 쉽게 생성 할 수있는 Arabidopsis 뿌리, 개발하고 있습니다. 그러나, mesophyll을 제외한, 잎과 함께 작업 할 때,이 원형질 생성 시간을 증가 할 필요가 있습니다. 따라서 원형질 생성 처리 자체 (데이터가 표시되지 않음)의 결과로 유전자 발현의 변화로부터 보호하기 위해 이러한 억제제를 포함하는 것이 중요합니다. 그러나 억제제의 존재이의 스트레스에 대응하기 위해되는 소성의 손실로 연결로 protoplasts 더 취약해질 가능성이 오프에 유전자 이상을, 전환하여하거나, 전사 반응을 마운트 할 수 없다는로 연결 절차를 protoplasting.
우리는 GFP-표현 Arabidopsis 라인의 번호를 성공적으로 여기에서 설명한 방법을 사용했습니다. 중요한 것은, 우리는 GFP 라인에서 또는 강력 GFP를 표현과 함께이 방법을 사용했습니다핵, 또는 더 약하게 non-localized/diffuse cytosolic 방식으로는 여기를 사용 KC464와 KC274 선 경우가 있습니다. 라인의 두 종류가 방법과 호환하고 GFP-표현 protoplasts의 매우 풍부한 분수 (그림 2, 3)을 얻을 수 있습니다. 형광이 죽은 / 죽어 세포의 autofluorescence 라이브 셀을 선택 할 수있는 능력을 유지하기 위해 크게 다를 수 있습니다 형광 선택해야합니다 있지만 방법은 쉽게 다른 fluorophores에 적용 할 수 있습니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
세포 유형과 발달 단계에 특정 프로파일에 부케 – Wollaston 실험실에서 작업은 유럽위원회 (European Commission)의 6 번째 프레임 워크 Progamme의 AGRON-OMICS 프로젝트 (부여 # LSHG-CT-2006-037704)에 의해 지원됩니다. 세포 유형 특정 프로파일에 기 포드의 연구소에서 일이 BBSRC 새로운 탐정 보조금 (BB/H019502/1)에 의해 지원됩니다.
KC274와 KC464 Arabidopsis 라인 AAR 웹 (캠브리지 대학)에서 얻었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
参考文献
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