Cella di analisi specifica di<em> Arabidopsis</em> Foglie usando fluorescenza activated cell sorting
概要
Un metodo per produrre<em> Arabidopsis</em> Protoplasti foglia che sono compatibili con selezione delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), consentendo studi di specifiche popolazioni cellulari. Questo metodo è compatibile con qualsiasi<em> Arabidopsis</em> Riga che esprime GFP in un sottogruppo di cellule.
Abstract
Dopo l'inizio del primordio fogliare, accumulo di biomassa è controllata principalmente da proliferazione cellulare ed espansione nelle foglie 1. Tuttavia, la foglia Arabidopsis è un organo complesso costituito da molti tipi cellulari diversi e strutture diverse. Allo stesso tempo, la foglia crescente contiene cellule a diversi stadi di sviluppo, con le cellule più lontane dal picciolo essere il primo a smettere espansione e sottoposti senescenza 1. Cellule diverse all'interno della foglia sono quindi dividendo, allungando o differenziazione, attivo, stressati o morti, e / o rispondere agli stimoli in sotto-insiemi di loro tipo cellulare in qualsiasi momento. Questo rende lo studio genomico della sfida foglia: ad esempio, l'analisi dei dati di espressione di foglie intere, i segnali provenienti dalle reti genetiche che operano in diverse zone di risposta cellulare o tipi cellulari saranno confusi, con un conseguente profilo impreciso viene generato.
Per risolvere questo problema, several metodi sono stati descritti che consentono studi di espressione genica specifica cella. Questi includono la cattura microdissezione laser (LCM) 2 o piante che esprimono GFP utilizzato per la produzione di protoplasti e la successiva selezione di fluorescenza delle cellule attivate (FACS) 3,4, il sistema recentemente descritto intatto per precipitazione nucleare 5 e immunoprecipitazione di polisomi 6.
FACS è stata utilizzata per un certo numero di studi, mostrando inoltre che l'identità della cella e della distanza dalla punta della radice avuto un effetto significativo sui profili di espressione di un grande numero di geni 3,7. FACS di linee GFP sono stati utilizzati anche per dimostrare cellule-specifiche regolazione trascrizionale durante risposte azoto radici e lo sviluppo delle radici laterali 8, 9 sale sollecitazioni distribuzione auxina nella radice 10 e per creare una mappa genica della Arabidopsis meristema apicale 11. SebbeneFACS è stata precedentemente utilizzata per ordinare protoplasti derivati foglia Arabidopsis basato su autofluorescenza 12,13, finora l'uso di FACS su linee di Arabidopsis esprimenti GFP nelle foglie è stato molto limitato 4. Nella seguente protocollo si descrive un metodo per ottenere protoplasti di Arabidopsis foglia che sono compatibili con FACS minimizzando l'impatto del regime generazione protoplasti. Dimostriamo il metodo utilizzando la linea KC464 Arabidopsis che esprimono GFP costrutto legato nell'epidermide adaxial 14, il KC274 linea, che esprimono GFP nel tessuto vascolare 14 e la linea di Arabidopsis TP382, che esprimono un GFP doppia ad un segnale di localizzazione nucleare le cellule di guardia (dati non mostrati; Figura 2). Stiamo attualmente utilizzando questo metodo per studiare sia del tipo cellulare specifica espressione durante lo sviluppo e stress, nonché popolazioni cellulari eterogenee in diverse fasi di senescenza.
Protocol
Discussion
Abbiamo descritto un metodo che permette l'utilizzo di piante di Arabidopsis esprimenti GFP nelle foglie per la generazione di protoplasti e cell sorting successiva utilizzando FACS. Questo metodo produce una quantità sufficiente di RNA per essere utilizzati per l'amplificazione e l'analisi successiva pertanto sia qPCR o microarray. Le frazioni vengono filtrate altamente arricchito per GFP contenenti cellule, come dimostrato da qPCR (Figura 2).
Per ottenere rese elevate di protoplasti vivi è fondamentale lavorare rapidamente durante le fasi iniziali della procedura, fino a quando le strisce sono state foglio vuoto infiltrato con l'inibitore soluzione contenente protoplasti. Inoltre, quando si genera uno strisce anta mm è molto importante per affettare o tagliare le foglie anziché 'chop' o schiacciare, in quanto questo porta ad un danno eccessivo e quindi un rendimento inferiore protoplasti.
Una differenza fondamentale tra il metodo descritto qui e publishe altrimetodi d è l'uso di inibitori di RNasi e inibitori trascrizionali. Molti metodi sono stati sviluppati per radici di Arabidopsis, da cui protoplasti possono essere generate più facilmente. Tuttavia, quando si lavora con foglie, ad eccezione mesofillo, è necessario aumentare il tempo di generazione protoplasti. Pertanto è importante che tali inibitori di protezione contro i cambiamenti nell'espressione genica come risultato del trattamento stesso generazione protoplasti (dati non mostrati). Tuttavia, la presenza degli inibitori porta ad una incapacità di montare una risposta trascrizione, sia attivando geni ON o OFF, che può realizzare i protoplasti più vulnerabili come questo porta ad una perdita di plasticità con cui contrastare le sollecitazioni del protoplasting procedura.
Abbiamo utilizzato il metodo descritto qui con successo con un numero di linee esprimenti GFP-Arabidopsis. È importante sottolineare che abbiamo usato questo metodo con le linee che esprime GFP GFP sia fortemente inil nucleo, o molto più debolmente in modo non-localized/diffuse citosolico, come è il caso con i KC464 KC274 e linee utilizzate qui. Entrambi i tipi di linee sono compatibili con il metodo e la resa frazioni altamente arricchito di GFP-esprimenti protoplasti (Figura 2 e 3). Il metodo può essere facilmente adattato per altri fluorofori, sebbene il fluoroforo deve essere selezionato per fluorescenza che è significativamente diversa dalla autofluorescenza di cellule morte / morenti per preservare la capacità di selezionare cellule vive.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro in Buchanan-Wollaston laboratorio sul profilo palco tipo cellulare e di sviluppo specifico è supportato dal AGRON-OMICS progetto (concessione # LSHG-CT-2006-037704) nel quadro Progamme 6 ° della Commissione europea. Il lavoro in laboratorio Gifford sul tipo cellulare specifico profilo è supportato da un nuovo BBSRC Investigator Grant (BB/H019502/1).
Le KC274 KC464 e linee di Arabidopsis sono stati ottenuti da AAR Webb (Università di Cambridge).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
参考文献
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