LabVIEW управлением Романа Nanoliter Осмометр для Ice привязки исследования белков
概要
Ice белков (IBPs), также известный как антифриз белков, тормозят рост и льда являются перспективными добавка для использования в криоконсервация тканей. Основным инструментом, используемым для расследования IBPs является nanoliter осмометра. Мы разработали дом-разработаны стадии охлаждения установлены на оптическом микроскопе и управляются с помощью заказных LabVIEW рутины. Осмометра nanoliter описанных здесь манипуляций температуры образца в ультра-чувствительной манере.
Abstract
Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа демонстрирует работу с компьютерным управлением nanoliter осмометра, что обеспечивает точное измерение TH деятельности с необычайной контроля температуры. В любом чувствительные к температуре системы, нежелательные температурные градиенты следует избегать. Чтобы избежать температурных градиентов в аппарате представлены здесь, капли исследуемого раствора должна быть расположена в центре отверстие в охлаждении медный диск этап (шаг 2,7). Кроме того, в одном кристалле должны быть в центре капли, а не по краям (в большинстве случаев, это произойдет спонтанно). Зависимость от времени описано показывает, что скорость охлаждения может повлиять на TH показания. Таким образом, мы предлагаем в том числе отчета о времени, в течение которого кристалл подвергается раствор до охлаждения, а также от скорости охлаждения. Как правило, мы ждали 10 минут до наращивает вниз температура на 0,01 ° C шаги каждые 4 сек.
LabVIEW совместно контролируемыхОлинг этапе был адаптирован для использования с помощью инвертированного микроскопа, на котором микрофлюидных устройства могут быть термически манипулировать. Эта система облегчает выполнение решений обмена эксперименты с кристаллами льда и IBPs отмеченных УЗФБ с 9, 10, 16. LabVIEW-управляемая система может быть адаптирована к сцене Clifton, подключив 3040 Регулятор температуры с помощью назначенных адаптации электрической цепи. Такая система работает в лаборатории Дэвис 17. Программное обеспечение LabVIEW и назначенный адаптации электрических схем для сцены Clifton предоставляются по запросу.
В заключение мы описываем nanoliter осмометра, что облегчает чувствительной контроля и манипуляции температуру и скорость увеличения температуры и уменьшение (с чувствительностью 0,002 ° C), согласованный с видео интерфейс, с помощью LabVIEW для рутинного анализа в реальном времени. Эта система может выполнять воспроизводимые скорости контролируемых экспериментов, которые являются importanт для исследования кинетики IBP взаимодействия со льдом. Такие эксперименты могут решить ряд давно обсуждаемая вопросы, связанные с механизмом действия IBPs.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано ISF, NSF, и ERC. Мы хотели бы отметить техническую помощь с температурой этапе от Рэнди Milford, Майкл Корен, Даг Шефер, и Джереми Dennison. Помощь в разработке программного обеспечения были предоставлены Или Чэнь, Сюй Ди, Раджеш Sannareddy, и Sumit Bhattachary. Мы хотели бы поблагодарить наших сотрудников Профессор Питер Л. Дэвис и доктор Лори А. Грэмом для белка Мп IBP и полезные обсуждения. Мы также благодарим лабораторию члены доктор Майя Бар-Dolev, Yangzhong Цинь, доктор Yeliz Челик, д-р Наталья Pertaya, Орталь Mizrahy, и Шломит Guy за их обратную связь с пользователем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number/model | コメント |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
参考文献
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis “antifreeze” protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. 生化学. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. 微生物学. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization – an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
