<em> 체외에서</em공부하기> 공동 감염 모델<em> Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서> - HIV-1 상호 작용

주 : HIV-1과 Plasmodium falciparum과 실험이 적절한 biosafety 수준의 실험실에서 수행되어야합니다 (기생충에 대한 BSL2 및 BSL3 HIV-1과 공동 감염)과 잠재적으로 감염된 사람의 혈액을 사용할 때 특별한주의가 납치되어야합니다. 1. 말초혈 Mononuclear 세포 (PBMC) 정화 (8, 9 일 기준) anticoagulants (헤파린, 구연산, 산성 구연산의 덱스 트로 오스 또는 구연산 인산 덱스 트로 오스)로 치료가 건강한 기증자 (500 ML)에서 신선한 인간의 피를 함께 시작합니다. 정화 및 분리 PBMC하고 프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 때 내독소없는 시약을 사용합니다. 70 % 에탄올과 함께 튜브를 포함한 혈액 가방, 소독, 튜브를 잘라 조심스럽게 T150 플라스크에 혈액을 전송합니다. 50 ML 원뿔 튜브 (Ficoll는 실내 온도에 도달했음을 확인) 당 15 ML Lymphocytes 분리 매체 (Ficoll) 16 튜브를 준비합니다.위에 신선한 혈액을 조심스럽게 층 30 ML. 20시 30 분 400 XG에서 원심 ° 떨어져 휴식 C #. 원심 분리하는 동안 튜브 방마다 온도 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 25 ML 8 X 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 조심스럽게 HBSS (튜브 당 수영장이 휴대폰 고리)를 포함하는 50 ML 튜브로 인터페이스에서 흐린 셀 링 (PBMC를 포함) 전송합니다. HBSS로 50 ML에 볼륨을 작성합니다. 20 15 분 150 XG에서 원심 °에서 휴식도 C #. 흐린 셀 링의 원심 분리하는 동안, Ficoll 단계, 50 ML 원뿔 튜브를 채울 수영장 플라즈마에서 노란색 상위 레이어를 수집합니다. ° C에서 30 분 동안하고 1,800 X g에서 10 분 스핀 56시 50 ML 튜브를 가열하여 플라즈마에 보완 Inactivate. 뜨는 (나중 단계에서 중간 보충으로 사용할 수 있습니다 포함되어 있습니다 희석 autologous 플라즈마)를 유지. 조심스럽게 뜨는 및 resuspen를 제거D 50 ML 관 당 HBSS와 수영장이 알약의 25 ML의 1.7 단계에서 세포 펠릿. 20 ° C.에 8 분 300 XG에 스핀 신중하게 뜨는을 제거 한 50 ML 튜브 10 ML의 HBSS와 수영장에서 알약을 resuspend. , 나누어지는을 가지고 사망률을 평가하기 위해 trypan 파랑 배제를 수행하고 PBMC를 계산합니다. HBSS 300 X g에서 10 분 스핀과 함께 50 ML 완료 볼륨. 표면에 뜨는를 제거하고 (하나는 혈액 500 ML에서 400-500 X 10 6 PBMC 주위를 취득한다) 5×10 6 셀 / ML에 RPMI 1640에서 셀을 resuspend. 2. Monocytes – 유래 Macrophages (MDM) 차별 (8, 9 일 기준) RPMI 1640 (25 ML / 접시)와 15cm 요리의 씨앗 약 1.25 X 10 8 PBMC. 세포가 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 1-2 시간 동안 준수합시다. 새로운 플라스크에 비 준수 세포를 전송 15 ML 내독소없는 PBS 회 (5 판을 씻어분, 300 XG). 준수 세포 절연 monocytes 있습니다. 갓 격리 monocytes가 MDM으로 차별화하도록하려면 5 % autologous 플라즈마 (단계 1.8부터)와 함께 보충 RPMI 1640 배지의 20 ML에 추가합니다. 인간 재조합 대식 세포의 콜로니 자극 인자 (M-CSF, 25 NG / ML) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 (PS, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신)를 추가합니다. 2 일 품어, 중간을 변경할 37 5퍼센트에서 ° C에서 CO 2 분위기에서 2-3 여분 일 부화. 오래된 매체를 제거하고 내독소 무료 PBS로 한 번 씻고, PBS를 부드럽게 추가하고 즉시 기음. 완전히 차별 MDM를 분리하려면, 5 % CO에서 37 ° C에서 15-20 분 ~ 7 ML Accutase (Accutase, 플라스틱 접시에서 세포의 분리를 허용 프로 테아제와 collagenolytic 활동의 상용 믹스)와 세포 치료 이 분위기, 중간 시간에 부드럽게 신난다. (세포를 보호하는 데 도움이되는 동안 각 플레이트에 3-5 ML autologous 플라즈마를 (단계 1.8에서) 추가) 부서. 부드럽게 매체가 50 ML 튜브의 모든 시간과 전송 / 수영장에서 전지를 다루고 있는지 확인하는 세포가 다쳤어요. 가능한 많은 세포로 복구하는 내독소 무료 PBS로 번호판을 씻어. 뜨는 삭제, 200 XG에서 5 분 던가. 5 ML MDM 문화 매체 (RPMI 1640 10% 보완-inactivated 태아 소 혈청 (iFBS), PS, 25 밀리미터 HEPES와 보충)와 카운트 세포 (MDM 총 PBMC의 보통 2~8%를 얻을)에 Resuspend 펠릿. 참고 : MDM의 나누어지는가 유동세포계측법하여 세포 인구 순결을 평가하기 위해이 단계에서 넘어 수도 있고 보통은 99 % MDM 급행 CD14을 획득하였습니다. 24 잘 접시에 잘마다 MDM 문화 매체 600 μl의 씨앗 1×10 5 MDM. 감염 전에 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 밤새 품어. 3. HIV-1 바이러스성 주식의 생산 및 Quantitation HEK293T 세포 follo에 칼슘 인산염 transfection을 사용하여 바이러스 주식을 생산Fortin 외의 날개 프로토콜. 10. R pHCMV-G의 +와 10 μg, 또는 NL4.3 룩의 15 μg – 중 NL4.3 루크 + 환경을 20 μg으로 루시페라제 인코딩 리포터 유전자를 포함하는 단일 사이클 바이러스, 공동 transfect HEK293T 세포를 얻기 위해 + 유럽 표준안 – R +와 pJRFL 유럽 표준안 중 15 μg. + 제어 당단백질 – 결함 바이러스를 생성 R – NL4.3 루크 + 환경을 30 μg을 사용합니다. 완전 replicative 바이러스의 경우 NL4.3Bal 유럽 표준안의 30 μg을 사용합니다. 벡터 pHCMV-G와 pJRFL 유럽 표준안은 각각 소낭성의 구염 바이러스의 봉투 glycoproteins (VSV-G)를 인코딩 및 CXCR5 – 열대 HIV-1 (NL4.3Bal 유럽 표준안 다를)으로. plasmids에 대한 자세한 내용은 8에서 얻을 수있다. Plasmids는 NIH 에이즈 연구 및 레퍼런스 프로그램 (NIAID, NIH)을 통해 얻을 수있다. HIV-1 p24 capsid 단백질 11 엘리사를 사용하여 모든 바이러스 주식을 수량그리고 사용하기 전에 자신의 감염 가능성을 확인합니다. 우리는 TZM-BL 표시기 세포 12 사용을 통해 바이러스 주식의 감염을 평가. 4. Plasmodium falciparum의 기생충의 문화 (13 기준) 기생충 4.1 일반 문화 및 유지 보수 P.를 유지 0.5 % (W / V) Albumax II, 25 μg / ML Gentamicin과 보완 RPMI 1640의 4 % 혈소판 (25 MM HEPES 및 25 밀리미터 NaHCO 3 버퍼)에서 인간의 적혈구 (혈액 그룹 O +)의 falciparum 3D7 성별이없는 무대 기생충 37시 370μM의 Hypoxanthine 질소의 1 % 산소 / 5 % 이산화탄소의 혼합 기체에서 ° C #. Parasitemia는 문화의 얇은 얼룩을하고 15 % Giemsa 용액으로 더럽히는 것으로 모니터링할 수 있습니다. 기생충은 컨트롤로 사용할으로 항상 동일한 조건에서 감염되지 않은 적혈구 (uRBC) 문화 요리를 유지합니다. 늦은 무대 parasit를 구하려면초밖에 (trophozoites / 조기 schizonts)는 다음과 같이 기생충을 동기화 : 4.2 기생충 동기화 아침에 300 XG에서 스핀 5 분 기생충 문화를 수확하고 뜨는 버리고. 5% (W / V) 37시 D-Sorbitol 및 부화 5 분 ° C. 5 만원 셀 볼륨에 Resuspend 펠릿 300 X g에서 5 분 던가, 30 ML 문화 매체에 뜨는, resuspend 펠릿를 버리고 인큐베이터에 다시 넣어. 약 8 시간 후 반복 단단히 동기 기생충을 얻기 위해 4.2.3에 4.2.1 단계를 반복합니다. 늦은 무대 기생충 (trophozoites / 조기 schizonts)은 다음 실험을 수행하기 위해 다음날 아침 수확한 수 있습니다. 이전 정화하기 전 라이프 사이클 단계를 확인하는 Giemsa의 염색법을 수행합니다. 4.3 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (iRBC) 정화 70 % 에탄올과 P로 VarioMacs 분리기 (스탠드와 자석)을 소독생물 학적 후드 밑에 레이스. CS 열 아래로 세 방향 꼭지를 수정합니다. Miltenyi 특수 커터와 바늘 플라스틱 프로텍터의 끝을 잘라 꼭지 바닥에 바늘을 고정시킨다. 신중 자석에 열을 잠금. 천천히 꼭지의 왼쪽에 엉망 키트 – 동봉된 주사기로 MDM 문화 매체의 10 ML을 주입하여 열에있는 모든 공기 방울을 제거합니다. ~ 20 ML MDM 문화 매체에 칼럼을 씻으십시오. 문화 판에서 수확 RBC는 10 ML MDM 매체 (300 XG, 5 분)로 한번 씻어 및 12 ML의 MDM 문화 매체에서 RBC 펠렛을 resuspend. 천천히 열을 추가하고 (trophozoite 또는 schizont 단계에 기생충을 포함하는 유일한 감염된 적혈구 인해 hemozoin 크리스털의 존재에 자기장에 의해 유지됩니다)를 통해 서스펜션 흘러가게. 20 ML 매체로 한번 씻어하고 열의 맨 위에있는 흰색 디스크에 도달하면 액체 흐름을 중지합니다. 12 ML MDM 문화 매체와 깨끗한 무균 튜브에 자석 및 elute의 iRBC에서 열을 제거합니다. 비방 회수 iRBC의 나누어지는과 Giemsa은 라이프 사이클 단계를 확인 더럽히는 것 수행합니다. 혈구계 (격리된 RBC 100 % iRBC입니다)를 사용하여 복구 iRBC 세어보세요. 펠렛 전지 (300 XG, 5 분), 뜨는 버리고 500 μl 신선한 AB + 인간의 혈청 (opsonisation 단계 14)로 세포를 치료. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 30 분 동안 품어. 원하는 농도로 iRBC 10 ML MDM 문화 매체 박스 (300 x G, 5 분), 그리고 resuspend에 한번 씻는다. 보통 10 % parasitemia 15cm 배양 접시는 대략 ~ 0.5-1×10 8 단단히 동기 iRBC을 제공합니다. 5. Plasmodium falciparum에 대한 MDM의 노출 75:1의 MDM : uRBC 또는 iRBC에 대한 MDM을 폭로하기 위해 세포 uRBC / iRBC의 비율을 얻기 위해 MDM 문화 매체에 resuspended해야합니다. 이전에MDM을 포함하는 준비된 24 잘 접시, 각도에 적절한 RBC 서스펜션 볼륨을 추가합니다. 세중의 모든 실험을 수행합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 4 시간을위한 공동 문화를 품다. 내독소없는 PBS 3 회 600 μl로 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 나머지 RBC를 lyse하려면 20 초 및 대기음을 위해 얼음처럼 차가운 멸균 물 200 μl를 추가하여 우물을 씻는다. 600 μl MDM 문화 매체를 추가하고 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 품어. 6. 완전 Replicative HIV-1과 MDM의 감염 P.의 효과를 평가하기 위해서는 MDM의 HIV-1 복제의 falciparum은 그림 1A, 해당 우물의 NL4.3Bal 유럽 표준안 바이러스의 p24의 10 NG (MDM 미디어 300 μl의)에 명시된 방식에 따라 추가, 컨트롤 우물에서만 MDM 매체를 추가하십시오 . 5에서 37 ° C에서 2 시간을 품다% 2 분위기를 공동. 내독소없는 PBS 3 회와 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 잘마다 신선한 MDM 매체 600 μl를 추가합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 품어. 일 3, 6, 9 및 12은 수확 후 신선한 MDM 매체 200 μl를 추가, 각 뜨는 200 μl, 바이러스 감염의 시작에 따라. Fortin 외 10. 따라 엘리사하여 주요 HIV-1 p24 capsid 단백질의 quantitation 위해 -20 ° C에서 수확 supernatants 보관하십시오. 7. 단일 사이클 바이러스 인코딩 루시페라제있는 MDM의 감염 R + (- MDM에서 HIV-1 유전자 발현에있는 기생충의 영향을 결정하기 위해서는, 10 NG p24 (MDM 매체 300 μl)을 NL4.3 루크 + 환경을 하나의, 그림 1B에서 설명한 방식에 따라, 추가 VSV-G), NL4.3 루크 + 환경을 – R + (JRFL 유럽 표준안) 또는 NL4.3 루크 +유럽 ​​표준안 – 해당 우물의 R은 + 바이러스. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 2 시간을 품어. 내독소없는 PBS 3 회 600 μl로 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 잘마다 신선한 MDM 매체 600 μl를 추가합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 품어. 매체 72 시간 다음과 같은 감염을 제거하고 용해 버퍼 1X (루시페라제 분석 키트와 함께 제공되는) 200 μl를 추가합니다. 세포가 부드러운 진동과 함께 실온에서 lyse하자. -20 ° C.에 저장 접시를 해동하고 96 잘 luminometer 플레이트에 lysate 40 μl를 전송, 루시페라제 기판의 100 μl을 (루시페라제 분석 키트와 함께 제공)을 추가하고 제조 업체의 지침에 따라 luminometer에서 루시페라제 (반딧불 루시페라제) 활동을 측정합니다. 8. 대표 결과 우리의 공동 감염 모델을 사용하여, 우리는 그 exposur를 보여P.의 전자 MDM의 falciparum는 HIV-1 감염에 그들의 자화율을 낮춥니다. 실제로 상당한 감소 (P는 <0.05, 2 방법으로 ANOVA, 하루에 12)와 같은 표면에 뜨는에서 HIV-1 p24 capsid 단백질에 의해 측정된 바이러스 입자의 릴리스는, 기생충 (그림 2A)와 pretreated MDM에서 관찰된다. 이러한 관찰은 루시페라제-리포터 유전자를 인코딩 바이러스에 감염된 세포에 확인됩니다. 외인성 VSV-G 또는 HIV-1 glycoproteins 중 하나를 품고 같은 바이러스와 MDM 감염은 P.에 노출된 세포에서 현저하게 (P <0.05, 학생의 T-테스트) 이하 루시페라제 생산에 이르게 falciparum (그림 2B). 그것은 VSV-G-pseudotyped 바이러스들이 JRFLenv 대응보다 훨씬 큰 루시페라제 활동을 발생한 주목할만한이며 이것은 VSV-G pseudotyped 입자 15보다 감염의 효율성 때문입니다. 기생충 박람회가 MDM의 영향으로 바이러스의 두 유형이 그것이 바이러스성 유전자 전처의 일부 단계에 영향을 미치는 것이 좋습니다 것을 감안할 때pression (그림 2B). 그것은 그 세포 생존 능력이 지켜지 억제가 세포 사망으로 인한 구체적이고 없다는 것을 나타냅니다 iRBC (데이터가 표시되지 않음)으로 MDM 박람회에 의해 영향을받지되었다 언급하는 것도 중요하다. 1 그림. 완전 replicative 바이러스와 MDM 감염) 플레이트 체계 모의 :. 감염되지 않은 세포. uRBC : 감염되지 않은 적혈구에 노출 세포. iRBC : Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구에 노출 세포. 발 :. NL4.3Bal 유럽 표준안 발 / uRBC에 감염된 세포 : 세포 uRBC에 노출하고 NL4.3Bal 유럽 표준안 발 / iRBC 감염 :.. MDM 감염 iRBC 및 NL4.3Bal 유럽 표준안 B로 감염된에 노출된 세포) 플레이트 방식으로 단일 사이클 루시페라제 인코딩 바이러스 모의 :. 감염되지 않은 세포. uRBC : 감염되지 않은 적혈구에 노출 세포. iRBC : 전지는 Plasmodium falciparum-I에 노출적혈구를 nfected. Δenv : NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 – R + JRFL :. NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 – R + (JRFL 유럽 표준안). vsv-G : NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 – R + (vsv-G) Δenv / uRBC :.. 세포 uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을-R + Δenv / iRBC 감염 : 세포 iRBC에 노출 그리고 NL4.3 루크 + 환경을 감염 – R + JRFL / uRBC : uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 – R + (JRFL 유럽 표준안).. JRFL / iRBC : iRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 – R + (JRFL 유럽 표준안). vsv-g/uRBC : uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 – R + (vsv-G) vsv-g/iRBC :. 전지 iRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염 – R + (vsv-G). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> 그림 2. 4. 시간을 위해 MDM)과 광범위하게 씻겨 : MDM의 HIV-1 바이러스 제작에 대한 Plasmodium falciparum의) 효과 MDM이 비율은 75:1 (uRBC / iRBC에서 uRBC 또는 iRBC에 노출되었다. 세포는 2 시간에 대한 p24 NL4.3Bal 유럽 표준안의 10ng에 감염되었다. 바이러스성 생산 초기 바이러스 감염에 따라 다른 시간 지점에서 셀 – 무료 뜨는에서 HIV-1 p24에 대한 엘리사에 의해 감시되었다. . 대표 실험은 MDM의 HIV-1 바이러스의 전사에 대한 Plasmodium falciparum의 B) 효과를 보이고있다 MDM이 비율은 75:1 (uRBC / iRBC에서 uRBC 또는 iRBC에 감염되었습니다. MDM). 루크 + 환경을 R + (JRFL 유럽 표준안) 또는 NL4.3 – – R + NL4.3 루크 + 유럽 표준안 – 셀 그런 다음 단일 사이클 바이러스의 p24의 10ng (중 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 R + (vsv- G)). 루시페라제 표현이 세포는 초기 바이러스 감염에 따라 72 시간을 lysates에서 평가되었다. 대표 실험이 나타납니다.