פיתחנו<em> במבחנה</em> מלריה-HIV-1 שיתוף זיהום מודל ללמוד את ההשפעה של<em> Plasmodium falciparum</em> על מחזור HIV-1 replicative של האדם הנגזרות מונוציטים מקרופאגים ראשוניים. מערכת זו צדדי יכול בקלות להיות מותאם אחרים סוגי התאים העיקריים לסכנת הדבקה ב-HIV-1.
Plasmodium falciparum, הסוכן סיבתי של הטופס הקטלני ביותר של מלריה, נגיף האיידס סוג-1 (HIV-1) הם בין הבעיות הבריאותיות החשובות ביותר ברחבי העולם, להיות אחראי על סך של 4 מיליון מקרי מוות בשנה 1. בשל החפיפה נרחבים שלהם באזורים המתפתחים, בעיקר באפריקה שמדרום לסהרה, עמיתים זיהומים עם מלריה ו-HIV-1 נפוצים, אבל את משחק הגומלין בין שתי המחלות הוא הבין היטב. דיווחים אפידמיולוגיים הראו כי זיהום מלריה זמני משפר HIV-1 שכפול ומגדיל עומס נגיפי HIV-1 ב שיתוף נגועים אנשים 2,3. בגלל viremia זה נשאר גבוה במשך כמה שבועות לאחר טיפול antimalarials, תופעה זו עשויה להיות השפעה על התקדמות המחלה ואת השידור.
מנגנוני החיסונית סלולריים מאחורי תצפיות אלו נחקרו רק בקושי. כמה מחקרים במבחנה investigating את ההשפעה של מלריה ב-HIV-1 הראו כי חשיפה אנטיגנים מלריה מסיסים יכולים להגדיל את ה-HIV-1 זיהום מחדש של תאים חיסוניים. עם זאת, מחקרים אלה השתמשו תמציות תאים שלמים של פ ' falciparum schizont טפילים בשלב ותאי דם היקפיים (mononuclear PBMC), מה שהופך את זה קשה לפענח איזה מרכיב מלריה (ים) היה אחראי על תופעות שנצפו ומה מארחים את התאים היעד היו 4,5. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חשיפה של מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים בשלים על פיגמנט hemozoin מלריה עלה יכולתם להעביר HIV-1 אל התאים CD4 + טי 6,7, אבל זה ירד זיהום HIV-1 של מקרופאגים 8. כדי לשפוך אור על תהליך מורכב זה, ניתוח שיטתי של אינטראקציות בין טפיל המלריה ו-HIV-1 של אוכלוסיות אנושיות שונות הרלוונטיות תאים ראשוניים יש צורך קריטי.
כמה טכניקות לחקור את ההשפעה של HIV-1 על phagocytosis של מיקרואורגניזמים ועל ההשפעה של פתוגנים כאלה על שכפול ה-HIV-1 תוארו. אנחנו כאן להציג שיטה לחקור את ההשפעות של פ ' falciparum נגועים אריתרוציטים על שכפול של HIV-1 של האדם הנגזרות מונוציטים מקרופאגים ראשוניים. ההשפעה של החשיפה טפיל על HIV-1 תעתיק / translational אירועים מנוטר באמצעות וירוסים מחזור יחיד pseudotyped שבו הגן כתב בלוציפראז החליף את הגן Env תוך השפעה על כמות של נגיף שפורסמו על ידי מקרופאגים נגועים נקבע על ידי מדידת HIV-1 החלבון p24 capsid ידי ELISA ב supernatants סלולריים.
הדגמנו כאן שתי גישות שונות לנתח את ההשפעה של טפיל המלריה על מחזור 1-HIV ויראלי, כלומר על ידי ניתוח או ביטוי גנים ויראלי או וירוס הצאצאים ייצור שכפול מונוציטים הנגזרות מקרופאגים. גישות דומות שימשו במשך שני HIV-1-טפיל שיתוף זיהומים 16. עם זאת, אלה הנתונים החדשים הם צעד קדימה בחקירה של מלריה-HIV-1 עמיתים זיהומים. . אכן, Diou ואח' 8 בחן את ההשפעה של hemozoin, טפילים לא חיים, על שכפול HIV-1, בהסכם עם התוצאות שלנו, הם הבחינו כי hemozoin עצמו היה מספיק כדי לדכא ייצור ויראלי ידי MDM, ולא MDMs.
באמצעות פריסת הניסוי המתואר, הבחנו כי פ falciparum מפעיל השפעה מזיקה ברורה על מחזור HIV-1 replicative ב מקרופאגים: עיכוב משמעותי של ייצור ויראלי הוא ציין מקרופאגים מראש שנחשפו טפילים (Figurה 2 א) וכן השפעה מסוימת של הטפיל על שעתוק ויראלי ממחישה 2B איור. עם זאת, אנחנו לא יכולים להשאיר את כל תופעות נוספות של הטפיל על כניסת היתוך או ויראלי (decapsidation) או לאחר שילוב מנגנונים, כגון סינתזה של חלבון או הרכבה החלקיקים ויראלי ניצני. יתר על כן, ייתכן כי השפעה שונה על שכפול HIV-1 היה לקבל אם הטפיל נוספו גם בעת ובעונה אחת או זיהום MDM הבאה עם הנגיף.
שלנו במודל שיתוף זיהום חוץ גופית מספק כלי רב עוצמה כדי לבצע חקירות מפורטות של HIV-1 / פ ' אינטראקציות falciparum של התא המארח. לדוגמה, שילוב של פריסת זה ניסיוני עם טכניקות אחרות, כגון PCR כמותי זמן אמיתי, שיכול למקד ולכמת צעדים ספציפיים retrotranscription ויראלי ואינטגרציה הגנום הנגיפי אל התא המארח הגנום, הם ריאלי למדי, צריך להניב insi נוסףghts לתוך המנגנונים המעורבים שיתוף זיהומים. יתר על כן, מבחני ספציפיות על מנת להעריך הצעדים הראשונים של מחזור נגיפית (ויראלית היתוך, decapsidation, quantitation הכניסה) ניתן ליישם פרוטוקול זה בסיסי עוד יותר לנתח את ההשפעה על שכפול נגיפי. שינויים אלו מראים כמה גמיש פרוטוקול זה הוא בנוגע HIV-1 quantitation זיהוי: אכן, גם תקן ה-HIV-1 הפוכה quantitation מבחני transcriptase באמצעות טריטיום שכותרתו נוקלאוטידים מתקבל על הדעת להחליף את ELISA ל-HIV-1 p24. בנוסף MDM, אנו מצפים המערכת שלנו להיות להתאמה סוגי תאים אחרים הנוגעים ל-HIV-1-מלריה אינטראקציות, כגון מונוציטים ותאים דנדריטיים. העובדה MDM הם תאים חסיד מאפשר מניפולציה שלהם, ומאפשר טיפול קל הכביסה מתוך iRBC שלא היה נלקח, או נמצאים בקשר עם MDM, ללא ביטול כל מקרופאגים. יתרון כזה לא יחול על תאים דנדריטים ומונוציטים, אשר בתרבית ההשעיה, שמסבך את SEparation של iRBC uRBC וחופשי עם תאים כאלה ואנחנו כרגע מענה לבעיה זו. המערכת שלנו יכולה להיות שימושית גם כדי לחקור אינטראקציות מורכבות יותר, כגון ההשפעה של Plasmodium-שנחשפו מונוציטים הנגזרות תאים על מחזור נגיפי HIV-1 בתאים חיסוניים אחרים כגון מסוג CD4 חיובי בתאי T של שיתוף תרבות ניסויים. לבסוף, פרוטוקול שלנו יכול להיות מתאים לניסוי מחפש את ההשפעה של פ ' falciparum iRBCs על הפעלה מחדש ב-HIV-1 PBMC ל-HIV-1 אנשים נגועים.
משפט ואתיקה
האדם PBMC התקבלו בדם של תורמים בריאים, בהתאם להנחיות ועדת אתיקה של המרכז הרפואי המרכז דה l'אוניברסיטת מחקר לאוול. הסכמה בכתב התקבל כל תורמי הדם.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי למחקר בריאות דרך Catalyst שיתופי זיהומים ועמיתים נלוות גרנט. אריתרוציטים האדם סופקו על ידי הבנק המרכז הרפואי de l'דם מאוניברסיטת לאוול.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
PBS-endotoxin free | Sigma | D8662 | |
FBS | Wisent | 080-150 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized |
Lymphocyte separation medium | Multicell | 305-010-CL | |
White luminometer plates | Promega | Z3291 | |
CS Macs separation columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
VarioMacs separator | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Wisent | 450-201-EL | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.1830 | |
24-Well Cell Culture Plates | BD Falcon | 353047 | |
150 x 20 mm culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | |
M-CSF | Genscript | Z02001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Human serum AB+ | Valley Biomedical | HP1022 | |
HBSS | Wisent | 311-505-CL | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
Human red blood cells | Obtained purified from CHUL blood bank. |