的产生,纯化和细胞浸润的细胞,胞浆全长DISC1蛋白aggresomes从细胞培养和标记,多聚重组DISC1蛋白片段中<em> E.大肠杆菌</em>进行说明。为受体细胞在细胞培养和神经元细胞的侵袭<em在体内</em>后脑接种stereotactical。
蛋白质聚集的被看到作为一个一般标志的慢性,退行性脑条件类似,例如,在神经退行性疾病中阿尔茨海默氏病(Aβ,tau蛋白),帕金森氏病(α-突触核蛋白),亨廷顿氏疾病(多聚谷氨酰胺,亨廷顿),和其他。蛋白质聚集被认为是发生不安proteostasis, 即错误折叠的蛋白质的产生和降解之间的不平衡。值得注意的是,同样的蛋白质被发现聚集在散发性疾病是罕见的变异的突变体在家族形式。
精神分裂症是一种慢性进行性脑部疾病,在许多情况下,伴随着一个永久性的,不可逆的认知功能障碍。在候选基因的方法,我们调查是否破坏精神分裂症1(DISC1),一个基因在苏格兰的家庭与联动,慢性精神疾病1,2,可以发现,作为不溶性聚集在腹腔n的3精神分裂症的散发病例。使用SMRI CC,我们发现在约20%的病例与CMD,但不正常的控制或与神经退行性疾病的患者的肌氨酸不溶于DISC1免疫生化分离后。随后的研究表明, 在体外的聚集倾向的DISC1疾病相关的基因多态性S704C 4的影响,并且在体外产生DISC1 aggresomes细胞侵入性的5,类似于已Aβ6所示,tau蛋白7-9,α -突触核蛋白11,10,多聚谷氨酰胺或SOD1的聚集体12。这些发现提示我们建议用CMD的至少一个子集的情况下,那些凝集DISC1可能会对蛋白质构象疾病。
在这里,我们将介绍如何在哺乳动物细胞中产生DISC1 aggresomes,净化他们的蔗糖梯度,并使用它们细胞侵袭STUDI的ES。同样,我们将介绍如何生成一个专门的多聚C-端DISC1片段,标签和净化细胞侵袭的研究。使用重组的多DISC1我们实现类似的细胞侵袭类似的标记合成的α-突触核蛋白片段。我们还表明,该片段在体内时,立体定位注射到受体动物的大脑。
在这项研究中,我们描述的净化起的mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes转染神经母细胞瘤细 胞系,准备和标签的重组DISC1蛋白种类和他们的应用程序在入侵细胞的受体细胞在体外和体内实验。
从协议开发的纯化的固有mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes隔离Lewy体样的结构和较大的聚集体13,14,但修改,以避免使用洗涤剂,以尽量减少可能发生的假阳性细胞入侵的风险由于洗涤剂促进的膜渗透。
一个可能的未来的改善可能是在进一步提高纯度的aggresomes通过超声完全分开,其余的细胞膜和细胞骨架的aggresomes。通过提高整体纯度总的入侵事件,,马大aggresomes记录可以增加5。有限的定义,我们建议的3相蔗糖是否是足够aggresomes其他蛋白物种,以进行测试,在这个意义上的协议这里列出应被视为单个优化的一个起点。的的纯化aggresomes被证明是相当强大的,在我们的手中,不用洗衣粉的洗涤步骤(),以消除痕迹蔗糖的整体收益率并没有显着减少。
在以前的出版物中,我们描述了低聚物的DISC1组装是依赖于不同的多聚化域的C-末端4( 图4)中。我们选择了这个片段在大肠杆菌中的可溶性表达的重组大肠杆菌和随后的Ni-NTA净化。为了监视它的多聚化,并比较其与所述的细胞侵入性的蛋白,如α-突触核蛋白细胞的侵袭性,我们标记DISC1(598-785)与荧光染料DyLight594中,和比较其同样标记的α-突触核蛋白细胞的侵袭。重组DISC1片段细胞侵袭力急剧增加相比,本地的,全长DISC1 aggresomes,可能是由于其更小的尺寸和更高的纯度。同样,的纯度似乎发挥了决定性的作用,在细胞侵袭。
在我们的例子中的侵入aggresomes招募可溶性同源蛋白的重组表达的靶细胞线在一种可溶性的, 即细胞分散的形式。一种荧光蛋白( 如 GFP或RFP)中的表达,在受体细胞线是一个优点,因为它允许通过Z堆叠成像侵入aggresomes和重组蛋白的共定位在受体细胞的限制之内。
从大肠杆菌表达和纯化的细胞侵入性的DISC1 aggresomes和多聚体片段大肠杆菌可能是一个定义功能的蛋白质构象病有关DISC1,DISC1opathies 15。
故障排除:
聚集小产量低蔗糖密度梯度纯化后:
在该协议中的蔗糖密度梯度介绍以及与eGFP/mRFP-DISC1(FL)aggresomes的。其他蛋白质组成的aggresomes可能会对因此可变尺寸应该优化的蔗糖浓度,由其他用户。
纯化的重组蛋白不足:
也将被标记的重组蛋白在纯化过程中的任何细菌污染物在后面的步骤的协议。为了避免污染,蛋白的SDS-PAGE上运行,并确认该重组蛋白是至少95%纯的,通过用考马斯亮蓝染色。为了保证最高的质量和产量,为每个蛋白质的协议进行优化。
低标签效应FICIENCY的重组蛋白:
包含游离SH基团的任何污染,会降低有效标记的蛋白质。因此,广泛的透析和Ni-NTA柱纯化是强制性的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由杜塞尔多夫大学医学系的Forschungskommission授出的的神经元ERANET发现(BMBF 01EW1003)CK和JPH,DFG(高1679/3-1; GRK1033)CKVB支持。
Reagent name | Company | Catalog number | コメント | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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