Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

1. Preparação de células doadoras Aggresome: transfecção de proteína monomérica Vermelho Fluorescente (MRFP) ou proteína verde fluorescente melhorada (EGFP)-marcado Comprimento Humanos completa (FL) DISC1 Semente de 1,5 x 10 6/10 cm prato neuroblastoma humano NLF (NLF; Hospital Infantil da Filadélfia, Philadelphia, PA) células em 10 placas de 10 cm e crescer durante a noite. Células NLF são cultivadas em RPMI-1640 suplementado com FBS 10%, penicilina / Strepomycin, L-Glutamina. No dia seguinte, as células devem estar a 70-80% de confluência. Transfectar transitoriamente cada prato de 10 cm com 15 ug de DNA de plasmídeo e o reagente de transfecção Metafectene (Biontex, Martinsried, Alemanha). Em resumo, para um prato de 10 cm, 15 ug de ADN plasmídico e 30 Metafectene ul foram adicionados a 750 ul de Opti-MEM, misturadas e incubadas à temperatura ambiente durante 20 min. 5 pratos foram transfectadas com pcDNA3.1 MRFP / eGFP-tagged humanos (FL) Disc1 e 5 pratos com a sós eGFP-plasmídeo. 2. AggresomeA purificação a partir de células do doador Transfectadas O protocolo aqui descrito é uma combinação de um método para purificar-Lewy Bodies a partir de tecido cerebral 13 e um protocolo para isolar grandes agregados e aggresomes 14. Uma vez que os métodos já existentes baseiam-se no uso de detergentes, o isolamento de detergente livre de proteínas para a aplicação em ensaios de células-invasividade é crítica. 48 h após a transfecção, monitorizar a expressão de eGFP e mRFP/eGFP-DISC1 e confirme a formação de aggresomes sob um microscópio de fluorescência (Figura 1). Lavar as células com PBS, pH 7,4, com 400 scrape ul de PBS cada, adicionar cocktail inibidor 1X Protease (Roche, Indianapolis, IN) e romper as células utilizando um homogeneizador Precellys24 (Bertin tecnologias, França). Resumidamente, adicionar 1 ml de suspensão de células para um tubo de lise 2 ml e adicionar 10 contas de cerâmica. Lisar as células com 3 x 60 pulsos seg. A força mecânica do processo podeaumentar a temperatura no interior da amostra acima de 37 ° C de modo deve ser tomado cuidado para refrigerar a amostra em gelo, após o procedimento de lise. Arrefecer as células sobre gelo e adicionam-se 10 mM de MgCl 2, 40 U / ml de ADNase A e incubar durante 60 min a 37 ° C Preparam-se soluções de 80%, 50%, sacarose a 20% (w / v) em PBS pH 7,4 (10 ml cada). Preparar o gradiente de sacarose em 15 ml de tubo falcon, começando com 2 ml de sacarose a 80%, seguido de 50% e 20%. Despeje o gradiente devagar e ter cuidado para não perturbar as camadas já derramadas. Camada do ligado digerido no topo do gradiente e centrifugar durante 15 minutos a 1000 xg, a 4 ° C. Recolher cuidadosamente a interfase entre a camada de sacarose a 50-80% com uma pipeta e misture com 5 volumes de PBS, pH 7,4. Centrifugar durante 15 minutos a 1000 xg, a 4 ° C. Repetir a lavagem duas vezes. Neste interfase, aggresomes são fluorescentes e podem ser visualizadas ao microscópio sob luz UV. Descartar o sobrenadante eressuspender o sedimento em 250-500 ul de PBS pH 7,4. Este pellet contém o aggresomes purificado (Figura 2). 3. Tratamento de destinatário SH-Sy5y Células com mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes Semente de 5 x 10 4 receptoras SH-Sy5y células de neuroblastoma humano constitutivamente expressando GFP-DISC1 (598-854), em lamelas de vidro estéreis em cada poço de uma placa de 24 poços. SH-Sy5y células são cultivadas em meio suplementado com DMEM/F-12 de penicilina / estreptomicina e não-aminoácidos essenciais (NEAA) e FBS a 10%. 24 horas mais tarde, adicionam-se 10 ul a cada poço e incubar durante 48-72 horas. Lavar as células 3 x com PBS pH 7,4 e extinguir a fluorescência extracelular com 0,04% de azul de tripano durante 5 min. Fixar as células com PFA a 4% em PBS, pH 7,4, durante 10 min em gelo, lava-se uma vez com H2O estéril e montar as lamelas sobre lâminas de vidro com prolongar ouro com DAPI meio de montagem (Invitrogen, EUA). Confirme a captação /invasão de exogenamente aggresomes aplicadas pela co-localização com proteínas recrutados expressas por células receptoras no Z-stack imagens. No entanto, a absorção / invasão de proteína exógena pode não ser detectada essencialmente em paralelo com o recrutamento de proteínas da célula hospedeira. No nosso exemplo MRFP-tagged DISC1 aggresomes recruta solúvel GFP-tagged DISC1 (598-854) da proteína expressa pela célula hospedeira (ver Figura 3). Fotos foram tiradas em um LSM Zeiss 510 a Zeiss confocal ou Axiovision Microscópio Apotome2. 4. Geração de DISC1 recombinante (598-785) Numa publicação anterior, foi analisada a capacidade de vários fragmentos de proteína Disc1 a auto-interagir com base na presença de auto-associação de domínios. Entre todos os fragmentos de proteína testada humano DISC1 (598-785) mostrada a propensão mais forte multimerização 4 (Figura 4). Portanto, DISC1 humana (598-785) foi clonado em pET15b (nVagen, Madison, Wisconsin), contendo um grupo N-terminal 6 histidina-tag, expressa em E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, EUA), e purificada em condições desnaturantes em ureia 8 mol / l, como descrito 4. Em resumo, o protocolo é descrito a seguir. BL21-(ide3) Rosetta E. coli foram cultivadas em 2 x 500 ml, contendo 5 mM de 2YT-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 mg / ml carbencillin, 35 ug / ml de cloranfenicol até uma OD 600: 0,6-0,8 e DISC1 (598-785) a expressão foi induzida com IPTG 1 mM. DISC1 (598-785) foi expresso durante 4 hr a 37 ° C, a expressão foi terminada pela colheita das bactérias por centrifugação. O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 50 ml de tampão TE (50 mM de TRIS-HCl pH 8,0, EDTA 5 mM) mais 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM de MgCl2 e 400 ml U/50 DNase I. A fim de garantir uma lise completa, a mistura reaccional foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. Adicionar 10 mM β-mercaptoethanol (ME) e 500 mM de NaCl, e incubar durante mais 30 minutos. Girar corpos de inclusão bacterianos em 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. Ressuspender o granulado em 50 ml de tampão de extracção contendo 50 mM de Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM β-ME e remover detritos por centrifugação a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. Lava-se a Ni-NTA agarose matriz com tampão de extracção. Incubar o sedimento, o extracto de proteína precleared com matriz de Ni-NTA durante 2 h à RT. Lava-se a matriz de Ni-NTA, com tampão de extracção contendo 12 mM de imidazole. Eluir a proteína lentamente com 15 ml de tampão de eluição contendo 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM de imidazole, 8 M de ureia, 1 mM PMSF, 5 mM de EDTA e 10 mM β-ME. Dialisar a proteína de passo a passo para PBS pH 7,4 contendo 10 mM de β-ME. A partir de 1 L de cultura bacteriana de partida, é possível isolar-se a 50 mg de DISC1 recombinante (598-785) protein. α-sinucleína redobragem Para experiências com α-sinucleína, 500 ug da proteína recombinante (Sigma-Aldrich, EUA) foi dissolvido em PBS a uma concentração de 1 mg / ml. Para obter oligómeros, a redobragem foi realizada durante a noite a 37 ° C, tal como descrito numa publicação anterior 10. 5. Rotulagem de DISC1 recombinante (598-785) com DyLight594 Antes do processo de marcação posterior, DISC1 (598-785) proteína tem a ser libertado de β-ME. Portanto, a proteína é dialisada três vezes com PBS pH 7,4 a uma diluição de 1:2000. Etiqueta de 1 mg DISC1 (598-785) com maleimida DyLight 594 (Thermo Scientific, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, dissolver 1 mg / ml de proteína em PBS pH 7,4 e adicionam-se 5 mM TCEP para recuperar grupos tiol livres. Adicionar 20 ul de corante dissolvido DMF à mistura reaccional e incuba-se durante 2 h à RT. Dialisar a proteína de 3 x de PBS pH7,4 a uma razão de 1:2000, durante 2 horas cada. Para aumentar ainda mais a pureza da proteína marcada a sua 6-tag de afinidade baseada purificação sobre uma coluna de Ni-NTA é executada. Lavar 1 ml de Ni-NTA de matriz (Qiagen, Alemanha) com 10 ml de PBS pH 7,4. Aplicar a proteína marcada, dialisado para a coluna e deixá-lo funcionar lentamente ao longo da coluna. Lava-se a proteína com 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 Eluir a proteína com PBS pH 7,4, 500 mM de imidazole, gota a gota enquanto se monitorizava a banda colorida na coluna de Ni-NTA para reduzir o volume de eluato. Dialisar o eluato a 3 x 10 mM NaPi pH 7,4 a uma diluição de 1:2000, durante 2 horas cada. Use uma seringa estéril 0,45 uM de filtro para filtrar o eluato, alíquota de 5 x 100 uL de amostras de encaixe e congelar em azoto líquido. A quantidade total de proteína deve ser 0,5-1 mg / ml, em cada alíquota de 100 ul. Concentr opcionalção passo Para injecções de rato stereotactical, a proteína foi concentrada 10 vezes num speed-vac (Concentrador de Eppendorf 5301). A condição de tampão final foi de 100 mM de NaPi. α-sinucleína Labeling A rotulagem e purificação (coluna de Ni-NTA), do recombinante α-sinucleína foi realizada em paralelo com DISC1 (598-785). O total de material de partida foi 500 ug em vez de 1 mg por DISC1 (598-785). 6. Tratamento de destinatário SH-Sy5y Células com rotulada DISC1 recombinante (598-785) Proteína Semente 5×10 4 receptor SH-Sy5y células de neuroblastoma humano constitutivamente expressando GFP-DISC1 (598-854), em lamelas de vidro estéreis em cada poço de uma placa de 24 poços. Adicionar proteína marcada para o meio de cultura celular numa concentração de 5-10 ug / ml e incubar durante 48-72 horas. Lavar as células 3 x com PBS pH 7,4 e extinguir extracçãofluorescência ellular com 0,04% de azul de tripano durante 5 min. Fixar as células com PFA a 4% em PBS, pH 7,4, durante 10 min em gelo, lava-se uma vez com H2O estéril e montar as lamelas sobre lâminas de vidro com prolongar ouro com DAPI meio de montagem (Invitrogen, EUA). Confirme a captação / invasão de exógena aplicada proteína recombinante por co-localização com proteínas recrutados expressas por células receptoras no Z-stack imagens geradas por laser microscopia confocal. No entanto, o recrutamento de proteína endógena pode não ser detectada, essencialmente em paralelo com a invasão de proteína da célula hospedeira, Z-stack imagens pode ainda confirmar a natureza invasiva da proteína. No nosso exemplo, rec. DISC1 (598-785) * pelo menos em parte solúvel recrutas GFP-tagged DISC1 (598-854) da proteína expressa pela célula hospedeira (ver Figura 5A). Para recombinante invasão α-sinucleína, mas não o recrutamento é mostrado (Figura 5B). Fotos foram tiradasnum Zeiss LSM 510 confocal ou um microscópio Zeiss Axiovision Apotome2. A injecção do concentrado (ca. 4 ul de 2,5 ug / uL), rotulada DISC1 (598-785) * para os resultados CPFm na difusão da proteína em volta do local de injecção, que pode ser detectada mesmo após a perfusão dos animais com 4% PFA em PBS, pH 7,4, com uma filterset rodamina. No nosso exemplo DISC1 (598-785) é ocupada por um número diferente de neurónios e pode ser monitorizado com Z-stack de imagem (Figura 6). Em geral, a injecção de outras proteínas, em seguida, os usados ​​aqui não conduzem necessariamente a invasão celular. O evento de invasão é essencialmente dependente da natureza da proteína, não obstante uma purificação limpa é um pré-requisito para análise posterior. 7. Resultados representativos Aggresomes recombinante consistindo de DISC1-eGFP FL purificada a partir de células invadidas NLF destinatário SH-Sy5y cells em baixa eficiência (cerca de 0,3 a 5%), como visto por co-localização com microscopia confocal (Figura 3). Como relatado anteriormente, DISC1 (598-785) expressa e purificada a partir de E. coli formadas multímeros 4 foram igualmente célula-invasiva com uma eficiência de aproximadamente 20% 5 (Figura 5A), semelhante ao de α-sinucleína, que foi utilizado em paralelo, como controlo positivo (Figura 5B). Rotulado DISC1 recombinante (598-785) expressa e purificada a partir de E. coli foi também célula-invasivo para neurónios in vivo, quando a proteína multimérica foi estereotaxicamente injectados no córtex pré-frontal de um rato (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, não publicado). Figura 1. Células de neuroblastoma que expressam transitoriamente NLF FP-DISC1 (vermelho). Red aggresomes fluorescentes pode ser deteCTED dentro das células. Figura 2. Purificada MRFP-tagged Disc1 aggresomes após a purificação em gradiente de sacarose. Figura 3. Imagem fluorescente de aggresomes invadidas. MRFP-tagged flDISC1 aggresomes foram purificados e incubados com as células de neuroblastoma SH-Sy5y overexpressing solúvel GFP-tagged DISC1 (598-854). Uma absorção de aggresomes rotulados é monitorado por Z-pilha de imagens em um microscópio Laser-Scan (Zeiss LSM 510). Figura 4. SEC-perfil de rec. DISC1 (598-785), contendo o S704 e os C704 polimorfismos de nucleotídeo único (SNP). Ambas as variantes apresentam uma ruptura de oligomerização e ordenou a formação de alto peso molecular multIMers (seta vermelha). Esta imagem é modificada a partir da publicação do Leliveld et al., Bioquímica 2009. Figura 5. Imagem Z-stack Fluorescente de invasivo DISC1 DyLight marcado recombinante (598-785). As células de neuroblastoma SH-Sy5y expressando GFP-DISC1 solúvel (598-854) foram incubadas com etiquetado, a proteína recombinante a uma concentração de 5 ug / ml. (A) agregados vermelha mostra a invasão de rec. DISC1 proteína (598-785) e pontos amarelos indicam um recrutamento de GFP-DISC1 solúvel (598-854) em agregados. (B) recombinante α-sinucleína (vermelho) invade as células sem recrutamento, com uma frequência de cerca de 20%. Clique aqui para ver maior figura . Figura figura 6. Imunofluorescência dea injectado rotulado DISC1, recombinante (598-785) da proteína. Z-stack de imagem confirma a presença de rec. DISC1 proteína (598-785), em neurónios corticais de rato coradas com um anticorpo contra núcleos neuronal (NeuN, verde).