細胞培養液からの細胞内、細胞質の全長DISC1タンパク質のアグレソームのとで標識し、多量換えDISC1タンパク質断片の生成、精製および細胞浸潤<em> E大腸菌の</em>記載されています。細胞の浸潤は、細胞培養とニューロンの受容細胞のために示されて<em生体内で></em> stereotactical脳接種後。
タンパク質凝集は、アルツハイマー病(Aβ、タウ)、パーキンソン病(α-シヌクレイン)、ハンチントン病(ポリグルタミン、チンチン)、および他の神経変性疾患、例えば、変性脳の条件が好きで、慢性の一般的特質として見られている。タンパク質の凝集が妨げproteostasisが原因で発生すると考えられ、発生したと誤って折り畳まれたタンパク質の分解との間の不均衡、 すなわち 。注目すべきは、同じタンパク質が家族性の稀少変異の変異であるこれらの疾患の散発型に集約発見されています。
統合失調症は、多くの場合、永久的で不可逆的な認知障害と一緒に行くの慢性進行性の脳の状態です。候補遺伝子アプローチでは、混乱·イン·統合失調症1(DISC1)、慢性の精神疾患1、2へのリンケージとスコットランドの家族の中でクローニングされた遺伝子が、BRAIに不溶性の凝集体として見つけることができるかどうかを検討nは統合失調症3の散発例。 SMRI CCを使用して、我々はCMDで例約20%で同定が、生化学的分画後の神経変性疾患ではない通常のコントロールや患者がサルコシル不溶性DISC1の免疫反応。 in vitroでのその後の研究は、DISC1の凝集傾向を疾患関連多型S704C 4の影響を受けていたことを明らかにし、in vitro で生成されたDISC1アグレソームはAβ6に示されていたものと同様の5、タウ7-9、α細胞侵襲的であったこと-シヌクレイン10、ポリグルタミン11、SOD1凝集体12。これらの知見は、私たちは、CMDを持つケースの少なくとも一部、集約されたDISC1とのそれらは、タンパク質立体配座の疾患かもしれないことを提案するように求められます。
ここで我々は、哺乳動物細胞におけるDISC1アグレソームを生成する方法を説明し、ショ糖密度勾配上でそれらを浄化し、細胞浸潤のストゥディのためにそれらを使用するES。同様に、我々は我々が独占的に多量のC末端フラグメントDISC1、ラベルを生成し、細胞浸潤の研究のためにそれを浄化する方法を説明します。 DISC1の組換え多量体を用いて、我々は同様に標識合成α-シヌクレインフラグメントの場合と同様の細胞浸潤能を実現しています。我々はまた、定位レシピエント動物の脳に注入する場合は、このフラグメントを in vivo で取り上げられていることを示している。
本研究では、トランスフェクトされた神経芽腫細胞株、組換えDISC1タンパク質種の準備とラベリングし、in vitro および in vivo での受容細胞の細胞侵入実験でそれぞれのアプリケーションからmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製について説明します。
ネイティブmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製は、レビー小体のような構造と大きな凝集体13,14を分離するためのプロトコルから開発されたが、洗剤の使用を回避し、発生する可能性の細胞浸潤、偽陽性のリスクを最小限にするように変更されました洗剤促進性膜浸透に起因する。
一つの可能な将来の改善がさらに完全にアグレソームから残っている膜と細胞骨格を分離するために、超音波処理によってアグレソームの純度を高めるためにあるかもしれない。 、大アグレソームミリアンペアのために記録合計侵攻イベントの数を全体の純度を高めることによりyは5を増加させること。私たちが提案した3相スクロースの限られた定義は、他のタンパク質種のアグレソームために十分であるかどうかをテストする必要があり、この意味では、プロトコルがここに概説さは、個々の最適化のための出発点として考慮されるべきである。精製アグレソームは、スクロースの痕跡が著しく全体の収率を低下させなかった排除するために、追加の洗浄工程(洗剤なしで)、私たちの手の中に非常に堅牢であることが判明した。
前の刊行物では、DISC1のオリゴマーアセンブリはC末端4( 図4)に明確な多量体化ドメインに依存していることを説明した。我々は、 大腸菌での組換え可溶性発現のために、この断片を選択しました大腸菌および後続とNi-NTA精製。その多量体化を監視するには、α-シヌクレインのように記載される細胞侵襲性のタンパク質とその細胞の浸潤を比較するために、我々は、蛍光色素DyLight594とDISC1(598から785)を標識し、比較してその均等に標識したα-シヌクレインのそれと細胞浸潤。組換えDISC1断片の細胞浸潤は劇的ネイティブ、全長DISC1アグレソームを、おそらくそれより小さいサイズとはるかに高い純度のためのそれに比べて増加した。繰り返しになりますが、純度は細胞浸潤に決定的な役割を果たしているように見える。
今回の例では侵襲アグレソームは、組換え可溶性、 すなわち細胞分散された形態で発現させた標的細胞株の可溶性ホモログタンパク質を募集した。それがZ-スタックイメージング経由受容細胞の制限内に侵襲アグレソームと組換えタンパク質の共局在化を可能にするので、レシピエント細胞ラインの蛍光タンパク質( 例えば、GFPまたはRFP)の発現が利点です。
大腸菌から発現および精製された細胞侵襲性DISC1のアグレソームおよび多量の断片大腸菌は、DISC1、DIに関連するタンパク質コンフォメーション病の決定的な特徴かもしれませんSC1opathies 15。
トラブルシューティング:
ショ糖勾配精製後の低aggresome収率:
このプロトコルで導入されたショ糖勾配はeGFP/mRFP-DISC1(フロリダ州)アグレソームでうまく動作します。他のタンパク質からなるアグレソームは変数の次元があるかもしれない従ってスクロース濃度は、他のユーザによって最適化されるべきである。
組換えタンパク質の精製が不十分:
組換えタンパク質の精製プロセスの任意の細菌汚染は、プロトコルの後の手順でラベル付けされます。汚染を避けるために、SDS-PAGEでタンパク質を実行し、組換えタンパク質は、クーマシーブルーで染色することにより、純粋な少なくとも95%であることを確認します。最高の品質と収量を確保するために、プロトコルは、個々の蛋白質のために最適化する必要があります。
低ラベリングEF組換えタンパク質のFICIENCY:
遊離SH基を含む任意の汚染は、タンパク質の効率的な標識を減少させるであろう。したがって、大規模な透析とNi-NTAベースの浄化は必須です。
The authors have nothing to disclose.
デュッセルドルフ大学医学部のForschungskommissionの助成金によってサポートされていますCKVBに、この作品は、CKとJPH、DFG(GRK1033コ1679/3-1)にニューロンERANET DISCOVER(BMBF 01EW1003)によって賄われていた。
Reagent name | Company | Catalog number | コメント | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|