דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים
概要
פלישת הדור, טיהור ותא של aggresomes התאי, cytoplasmic אורך המלא DISC1 חלבון מתרביות תאים ומתויג בר, multimeric רקומביננטי DISC1 חלבון<em> א coli</em> מתוארים. הפולשנות סלולרית מוצגת לתאי נמען בתרבית תאים ונוירונים<em> In vivo</em> לאחר חיסון המוח stereotactical.
Abstract
צבירת חלבון נתפסה כסימן היכר כללי של תנאי מוח כרוניים, ניווניות כמו, למשל, במחלות ניווניות מחלת אלצהיימר (Aβ, טאו), מחלת פרקינסון (α-סינוקלאין), מחלת הנטינגטון (polyglutamine, huntingtin), ואחרים. צבירת חלבון היא חשבה להתרחש עקב proteostasis המופרע, כלומר חוסר האיזון בין נובע ופירוק חלבוני misfolded. מן ראוי לציין כי את אותם החלבונים נמצאים מצטברים בצורות ספורדיות של מחלות אלו שמוטציה בגרסות נדירות של צורות משפחתיות.
סכיזופרניה היא מחלה כרונית פרוגרסיבית מוח שבמקרים רבים הולכים יחד עם גירעון הקוגניטיבי קבוע ובלתי הפיך. בגישת גן מועמד, אנחנו בדקנו אם 1 שבשנו ב-סכיזופרניה (DISC1), גן משובט במשפחה סקוטית עם הצמדה למחלה כרונית נפשית 1, 2, יכולה להימצא כאגרגטים מסיסים בbrain של מקרים ספוראדיים של סכיזופרניה 3. שימוש CC SMRI, זיהה בכ 20% ממקרים עם CMD אבל לא ביקורת רגילה או חולים עם מחלות ניווניות immunoreactivity DISC1 sarkosyl מסיס לאחר החלוקה ביוכימי. מחקרים מאוחרים יותר במבחנה גילו כי נטיית הצבירה של DISC1 הושפעה פולימורפיזם מחלה הקשורה S704C 4, ושDISC1 aggresomes שנוצר במבחנה היו תא פולשנית 5, בדומה למה שכבר הוכח לAβ 6, 7-9 טאו, α סינוקלאין-10, 11 polyglutamine, או SOD1 אגרגטים 12. ממצאים אלה הניעו אותנו להציע שלפחות משנה של מקרים עם CMD, אלה עם DISC1 המצטבר עלולים להיות הפרעות חלבון קונפורמציה.
כאן אנו מתארים כיצד אנו יוצרים DISC1 aggresomes בתאי יונקים, לטהר אותם בשיפוע סוכרוז ולהשתמש בם לStudi תא הפולשנותes. כמו כן, אנו מתארים כיצד אנחנו מייצרים C-מסוף DISC1 בר, תווית באופן בלעדי multimeric ולטהר אותו ללימודי הפולשנות סלולרית. שימוש בmultimers רקומביננטי של DISC1 להשיג הפולשנות תא דומה כמו לבר סינטטי שכותרת דומה α-סינוקלאין. אנו גם מראים שקטע זה נלקח בvivo כאשר מזריקים stereotactically לתוך המוח של בעלי חיים מושתלים.
Protocol
Discussion
במחקר זה אנו מתארים טיהור mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes מקו transfected נוירובלסטומה תא, ההכנה ותיוג של DISC1 מיני חלבון רקומביננטי והיישום שלהם בניסויי תא פלישה של תאי נמען במבחנת in vivo.
טיהור mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes ילידים פותחה מתוך פרוטוקולים לבודד מבנים לוי גוף דמויים ואגרגטים גדולים 13, 14, אבל שונה כדי להימנע מהשימוש בחומרי ניקוי וכדי למזער את הסיכון של תא פלישה חיובית כוזב שעלולה להתרחש עקב חדירת חומר ניקוי קרום הקל.
שיפור עתיד אפשרי אחד יכול להיות בהמשך להגדיל את הטוהר של aggresomes ידי sonication ללחלוטין קרומים שנותרו נפרדים וcytoskeleton מaggresomes. על ידי טוהר כולל גובר, מספר אירועי פלישה כלל שנרשם לaggresomes ma גדולy להיות מוגבר 5. אם בהגדרה המצומצמת של סוכרוז הציע 3-השלב די לaggresomes של מיני חלבון אחרים יש להיבדק, במובן זה הפרוטוקול המתואר כאן צריך להיחשב כנקודה מוצאת לקידום פרט. את aggresomes המטוהר הוכיח להיות די חזק בידות שלנו, שלבי כביסה נוספים (ללא חומרי ניקוי) לחסל את העקבות של סוכרוז לא להפחית באופן משמעותי את התשואה הכוללת.
בפרסום קודם שתארנו שהרכבת oligomer של DISC1 תלויה בתחומי multimerization נפרדים בתחנה הסופית של C-4 (איור 4). בחרנו קטע זה לביטוי רקומביננטי המסיס בE. coli ושלאחר מכן וטיהור Ni-נ.ת. ע. כדי לפקח multimerization ולהשוות את הפולשנות התא שלה עם חלבון תאר תא פולשנית כמו α-סינוקלאין, אנחנו מתויגים DISC1 (598-785) עם צבע פלואורסצנטי DyLight594, ולעומתהתא הפולשנות עם זה של תווית באופן שווה α-סינוקלאין. תא הפולשנות של DISC1 בר רקומביננטי הייתה גדל באופן דרמטי בהשוואה לזה של ילידי אורך מלא DISC1 aggresomes, כנראה עקב גודל קטן יותר וטוהר גבוה בהרבה. שוב, טוהר נראה לשחק תפקיד מכריע בתא הפולשנות.
בדוגמא שלנו את aggresomes פולשניים גייס חלבון מסיס homologue של קו תא היעד שהתבטא recombinantly בצורה מסיסה, כלומר תא מפוזר-. הביטוי של חלבון פלואורסצנטי (למשל GFP או RFP) בשורת תאי הנמען הוא יתרון שכן הוא מאפשר colocalization של aggresomes פולשניים וחלבונים רקומביננטיים בתוך מגבלת תא הנמען באמצעות הדמית Z-מחסנית.
aggresomes DISC1 תאים פולשניים ושברי multimeric הביעו ומטוהר מE. חיידק יכול להיות תכונה מגדירה של מחלות קונפורמציה חלבון הנוגעים לDISC1, DISC1opathies 15.
צרות קליעה:
תשואה נמוכה aggresome לאחר טיהור שיפוע סוכרוז:
שיפוע סוכרוז הציג בפרוטוקול זה עובד היטב עם aggresomes eGFP/mRFP-DISC1 (פלורידה). Aggresomes המורכב של חלבונים אחרים עשויה להיות מידות משתנות ולכן ריכוזי סוכרוז צריכים להיות מותאמים על ידי משתמשים אחרים.
טיהור בלתי מספקת של חלבון רקומביננטי:
כל זיהום חיידקים בתהליך הטיהור של חלבון רקומביננטי גם להיות מתויג בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. כדי להימנע מזיהומים, להפעיל את החלבון על SDS-PAGE ולוודא כי חלבון רקומביננטי הוא לפחות 95% טהור ע"י השאיר עם Coomassie הכחול. כדי להבטיח איכות ואת התשואה הגבוהה ביותר, בפרוטוקול יש להיות מותאם לכל חלבון בודד.
נמוך התיוג EFficiency של חלבונים רקומביננטיים:
כל זיהומים שמכילים קבוצות SH חופשיות יקטנו תיוג יעיל של החלבון. לכן, דיאליזה נרחבת וטיהור מבוססת Ni-נ.ת. ע הוא חובה.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NEURON-Eranet גלה (BMBF 01EW1003) לCK וJPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) לCKVB נתמך על ידי מענק של Forschungskommission של הפקולטה לרפואה באוניברסיטת דיסלדורף.
Materials
| Reagent name | Company | Catalog number | コメント | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
参考文献
- Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
- Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
- Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. 生化学. 48, 7746-7755 (2009).
- Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
- Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
- Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
- Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
- Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
- Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
- Munch, C., O’Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
- Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
- Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
- Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).
