세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em> Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서> Amastigotes

정량 분석​​은 24, 48, 72 및 96 시간 후 약물 치료를 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 기생충 – 구조 – 변환 – 검정 모두 이루어졌다 L.의 직접 계산 방법, 감염의 donovani에 감염된 대 식세포 (THP1 세포)은 다음 식에 의해 계산 : amastigotes (amastigotes의 핵을 계산에 의해 결정) / 100 THP1 세포 (THP1 세포 핵에서 계산 계산에 의해 결정) (그림 7)이 감염된 THP1 세포의 비율보다 다른 표준 또는 시험 화합물의 효과를 분석 할 수있는보다 정확한 측정하기위한 한 방법입니다 변환 이 번호는 직접 화합물의 전체적인 효과에 관한되기 때문에 같은, 일부 이전 신문에 보도 중 감소를 통해대 식세포의 cells.Infection에서 대 식세포 셀이나 기생충 총 제거에서 기생충의 다양한 시간 간격 (그림 10, 표 1)에 대해 서로 다른 dilutions에 다른 표준 약물로 치료가 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지에서 계산되었다. 기생충 – 구조 – 변환 – 검정을위한 상대 형광 단위 (RFU)였다 읽기 아웃하면서 읽기 아웃은 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 검정을위한 amastigotes infection/100는 THP1 세포를 변형 한 직접 감염된 대 식세포에서 구출 라이브 Leishmania의 amastigotes의 수에 비례하여 promastigotes로 변환 할 수 있습니다. alamarBlue 분석은 정기적으로 Leishmania promastigotes 방지 leishmanial 약물 검사에 사용됩니다. 검정은 처음 표준화 및 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 제어 용해에 최적화했다. 목표는 세제 화려 조건을 최적화하는 것이 었습니다구조 amastigotes의 생존에 최소한의 효과 THP1 세포의 거의 완전한 용해를 얻을 수 atment는. 그림 1은 전체 분석 프로토콜의 미세한보기를 도시한다. Leishmania의 amastigotes에 감염 그대로 THP1 셀이 그림 1A에서 볼 수 있습니다. 그림 1B는 세제 치료 후 THP1 세포의 용해를 보여줍니다. 그림 1C가 부분적으로 promastigotes와 그림 1D로 변신 한 Leishmania amastigotes를 구출 표시하기에 amastigotes의 거의 완전한 변화를 보여줍니다 promastigotes 및 후속 확산. 이러한 변화 promastigotes의 성장은 양적 alamarBlue의 추가 및 microplate 리더에 형광 측정을 모니터링 할 수 있습니다. NP-40 (그림 2A) 및 트라이 튼 X-100 (그림 2B)와 치료는 감염된 THP1 세포를 lysed하지만, 또한 생존에 영향을하고구조 amastigotes의 변화. 십대 초반 20 (그림 2C)과 십대 초반 80 (그림 2D)의 치료는 변형 promastigotes의 낮은 숫자로 표시로 amastigotes의 불완전한 구조로 인해 THP1 세포의 최적의 용해가되지 않았다. 30 초에 0.05 % SDS (그림 2E)의 치료는 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 거의 완전한 용해가 생긴과 탈출의 amastigotes의 생존과 변화에 영향을 미치지 않았다. 또한 최적화 초이 가능한 Leishmania의 amastigotes (그림 2 층)의 높은 구조가 생긴 20-30에 0.05 % SDS와 함께 세포의 치료를 보여 주었다. 후속 실험에서, 30에 대한 0.05 % SDS 치료는 초를 사용했습니다. SDS 처리를위한 절차는 하나 또는 여러 개의 플레이트에 대해 동일합니다. 여러 접시에서 SDS 치료는 멀티 채널 피펫과 열에서 열을 구현되었습니다. 혈청 무료 매체는 모두 8 판 중 하나를 열 우물과 20 & 무에서 삭제되었습니다, 0.05 % SDS의 리터는 동일한 열 여덟 우물에 추가와 10 % FBS와 RPMI-1640을 30 초 후 희석되었다. 분석 초기 표준화 동안 접시가 아닌 internalized promastigotes에 대한 현미경으로 확인되었다. 오 washings의 최소 표준 화합물과 세 washings SDS 치료의 7 단계 전에 필요한있었습니다 감염된 대 식세포 세포 치료의 5 단계 전에 기생충의 제거에 필요한습니다. 따라서, 셀은 8 번 세탁하고 눈에 띄는 비 internalized promastigotes는 감염된 THP1 세포의 제어 용해되기 전에 남아 없습니다. 디지털 이미지 분석 및 직접 계산 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지는 (그림 3 SYBR 그린 I.와 착색 특성 kinetoplast의 DNA와 대 식세포의 핵 및 세포 Leishmania의 핵 모두가 형광 필터에서 관찰 된 이후 니콘 이클립스 90i 형광 현미경에 잡혀). 또한, 감염된 THP1 세포의 이미지도 DIC에서 촬영되었다. 이미지 모두가 병합되었을 때, 세포 amastigotes과 THP1 전지의 개요는 (그림 4) 더 명확하게 볼 수 있었다. ImageJ 소프트웨어는 이러한 이미지를 분석하는 데 사용되었다. ImageJ는 건강 (국립 연구소에서 개발 된 공개 도메인, 자바 기반의 이미지 프로세싱 프로그램입니다 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ는 Java 플러그인과 기록 매크로를 통해 확장 성을 제공하는 개방형 아키텍처로 설계되었습니다. 사용자 지정 획득, 분석 및 처리 플러그인은 ImageJ에 내장 된 편집기와 자바 컴파일러를 사용하여 개발 할 수 있습니다. ImageJ에 의한 THP1 셀 핵 및 기생충의 핵의 카운트 차등를 들어, 이미지가 ImageJ에 문을 열었습니다. 셀 카운터는 소프트웨어의 플러그인에서 분석 옵션에 발견되었다. 이미지가 초기화되었고 셀 카운터 유형 1 THP1 C에 선정되었습니다예쁜의 핵 및 세포 카운터 타입 2 기생충의 핵 (그림 3)에 선정되었습니다. 미분 계수는 최소한 200 THP1 세포 핵 이러한 THP1 세포 핵에 존재하는 세포 amastigotes에 이루어졌다. 기생충 – 구조 분석 및 이미지 분석 방법의 비교는 서로 다른 대 식세포와 THP1 세포의 감염을 평가되었다 :. promastigote 비율 : promastigotes 비율 (그림 4) 그림 5는 다른 대 식세포에서 THP1 세포의 차등 감염을 나타냅니다. 방법 모두 비교 결과와 대 식세포를 보여 주었다 : 1시 10분의 promastigote 비율이 최적와 재현 감염이 나왔고. parasite-rescue/transformation 분석 및 디지털 이미지 분석을위한 조건이 최적화 된 후, 이러한 assays의 유틸리티는 반 leishmanial 약물 검사에 대한 평가되었다. Leishmania에 감염된 THP1 전지가 표준의 서로 다른 농도로 치료했다즉 nti-leishmanial 약물 Amphotericin B, 24 일부터 96 시간에 이르기까지 서로 다른 시간 간격에 대한 Pentamidine 및 Miltefosine. 기생충에 대한 실험은 / 변환 분석은 세중의에서 수행 된 구조 및 방법을 계산 직접 세포에 대한 실험은 복제로 이루어졌다. 그림 6은 치료와 Leishmania에 감염된 감염 감염되지 않은, 제어, THP1 세포를 처리 컨트롤의 현미경 이미지를 보여줍니다. 선량 반응 곡선은 기생충 – 구조 및 변화 분석 (변형 기생충 대 약물의 농도)과 이미지 분석 분석 (amastigotes/100 THP1 세포의 수) (그림 7-9)에서 준비되었다. 마약의 IC 50 ExcelFit에 의해 계산되었으며 표 1에 표시됩니다. 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 기생충 – 구조 – 변환 – 분석은 유사한 결과를 보여 주었다. 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 검정은 초기 24 시간 지점 및 48 시간 약물 t 동안 적은 최적이었다reatments, 기생충 – 구조 – 변환 – 검정은 약물 치료 후 24-96 시간 동안의 모든 시간 지점에서보고 된 값보다 일관된 결과를 보여 주었다 동안. 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 기생충 – 구조 – 변환 – 검정과 결과의 이러한 차이는 디지털 이미지 분석 – 직접 세기의 약물 치료의 조기 기간 동안 비 가능한 amastigotes의 존재 때문일 수 있습니다 – 검정. 그림 1. Leishmania donovani의 현미경보기 promastigotes에 구조와 변화를 amastigotes. A – Leishmania amastigotes에 감염 자기편 THP1 세포, B – 제어 용해 C 한 후 점착성의, 감염된 THP1 셀 – 감염된 THP1 대 식세포 세포 D에서 구출 amastigotes에서 Leishmania donovani의 promastigotes을 변화 – 트란의 성장과 확산sformed Leishmania donovani이 promastigotes. 다른 세제와 Leishmania에 감염된 THP1 세포에서 amastigotes의 THP1 세포 구조의 용해의 그림 2. promastigotes에 라이브 Leishmania donovani의 amastigotes과 변화의 최대 구조를 달성하기 감염된 THP1 세포의 제어 용해의 최적화. 분석. 세제의 두 가지 농도 (0.05 % 및 0.1 %) 및 ​​치료를위한 두 가지 기간은 (30 초와 60 초) 테스트되었습니다. RFU는 = 상대 형광 단위입니다. 각 줄이 중복 관찰의 평균을 나타냅니다. [A] NP-40 치료 THP1 세포의 용해를 야기하고 또한 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을. [B] 트리톤 X-100 treatmeNT는 THP1 세포의 용해를 야기하고 또한 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을 [C] 십대 초반 80 amastigotes를 구출하기 위해 THP1 세포의 부분적인 용해를 일으켰습니다. [D] 십대 초반 80 amastigotes를 구출하기 위해 THP1 세포의 부분적인 용해를 일으켰습니다. [E ] SDS 치료는 THP1 세포의 거의 완전한 용해의 원인 및 0.05 % / 30에서 구출 amastigotes의 생존에 영향을 미치지 않은 초. [F 20-30에 0.05 % SDS에] 치료 sec는 THP1 세포의 거의 완전한 용해의 원인과 가능한 기생충을 구출 promastigotes로 변환 할 수 amastigotes이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 3. Leishmani와 함께 체외에 감염 차별화 된 THP1 세포의 형광 디지털 이미지donovani이 amastigotes. 특성 kDNA 또한 각 기생충 핵으로 볼 수 있습니다. 대 식세포 핵 (MN) (1) 및 기생충의 핵 (PN) (2) 감염의 정량 평가를위한 ImageJ 분석 소프트웨어로 differentially 표시하고 differentially 계산 할 수 있습니다. 정량화가 amastigotes/100 THP1 세포의 숫자로 이루어졌다. 그림 4. 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 검정 (하단 패널)과 기생충 – 구조 – 변환 – 검정 (위 패널) 사이 비교. 대 식세포 : 1시 10분의 promastigote 비율이 최적의 감염을 굴복. 모두 유사한 결과를 보여 주었다. 기생충 – 구조 분석은 몇 가지 배경 값을 보여 주었다. 각 막대 쇼 중복 값 의미합니다. <img alt="그림 5" src = "/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg"/> 그림 5 개의 THP1에 의해 Leishmania의 promastigotes에 감염 THP1 셀 :. promastigote 비율입니다. amastigotes/100 THP1 세포의 수와 같은 양적 결과는 그림 4에 표시됩니다. 그림 6. Leishmania donovani에 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지는 (형광등 + DIC) 다른 기간에 대한 표준 안티 leishmanial 약물 치료 후 amastigotes. 결과는 amastigotes/100 THP1 세포의 숫자로 정량화 및 치료 컨트롤에 비해 %의 성장을 계산하고 IC 50 값을 결정하는 데 사용되었다. <img alt="그림 7" fo: 콘텐츠 폭 = "4.75in"강한 : src = "SRC" > 그림 7.의 비교 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사 (Amophotericin B)에 대한 기생충 – 구조 – 변환 – 검정. 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 8.에 대한 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 기생충 – 구조 – 변환 – 분석의 비교nti-leishmanial 약물 검사 (Pentamidine). 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 9.의 비교 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사 (Mitefosine)에 대한 기생충 – 구조 – 변환 – 검정. 감염된 대 식세포는 다른 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다.큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 시험 약물 24 시간 48 시간 72 시간 96 시간 IACA B PRTA C IACA B PRTA C IACA B PRTA C IACA B PRTA C Amphotericin B 0.24 ± 0.03 0.17 ± 0.01 * 0.12 ± 0.04 0.20 ± 0.07 0.06 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.11 ± 0.03 0.10 ± 0.03 Pentamidine > 10 2.55 ± 1.16 * 2.88 및 PLusmn, 0.58 1.43 ± 0.91 1.24 ± 0.35 1.52 ± 0.16 0.71 ± 0.63 0.98 ± 0.33 Miltefosine 0.38 ± 0.02 0.19 ± 0.08 * 0.24 ± 0.06 0.30 ± 0.08 0.36 ± 0.02 0.16 ± 0.06 0.21 ± 0.15 0.17 ± 0.10 표 1. 디지털 이미지 분석 – 직접 세기 – 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사에 대한 기생충 – 구조 – 변환 – 분석의 비교. 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit (그림 7-9)에 의해 선량 반응 곡선에서 계산 된 시간 후 약물 치료,. B IACA = 이미지 분석 및 직접 계산은검정, C PRTA = 기생충 – 구조 및 변환 분석. 주어진 값은 μg / ML로 IC 50 (기생충의 성장에 50 % 억제를 일으키는 약물의 농도)이며 적어도 세 실험의 평균 ± SD 있습니다. * (<0.05) 통계적으로 다르게 IACA으로 IC 50 값으로 비교했다.