細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験<em>ドノバンリーシュマニア</emTHP1ヒト急性単球性白血病細胞株における>無鞭毛

定量分析は、24、48、72及び96時間後の薬物治療のためのデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの両方に対して行われた L.の直接計数法、感染症のドノバン感染マクロファージ（THP1細胞）は、次式により算出した： 無鞭毛（無鞭毛体の核を計数することによって決定）/ 100 THP1細胞（THP1細胞核でカウントカウントすることによって決定される）（ 図7）が感染したTHP1細胞の割合は異なる規格や試験化合物の効果を分析するためのより正確な尺度で変換は、この数値を直接化合物の全体的な効果に関連しているため、どちらの減少により、以前のいくつかの論文で報告されたようにマクロファージ細胞やマクロファージcells.Infectionから寄生虫の全摘出の寄生虫の様々な時間間隔の異なる希釈（ 図10および表1）に異なった標準薬で治療感染THP1細胞のデジタル画像から算出した。デジタル画像解析ダイレクト·カウント·アッセイのための読み出し寄生レスキュー変態アッセイのための読み出しである相対蛍光単位（RFU）であったが、無鞭毛infection/100が、THP1細胞を形質転換した直接感染マクロファージから救出ライブリーシュマニア無鞭毛の数に比例し、前鞭に変身。 alamarBlueアッセイは日常リーシュ前鞭抗リーシュマニア薬のスクリーニングのために使用されます。 アッセイは、最初に標準化され、 リーシュマニア感染THP1細胞の制御された溶解用に最適化された。目的は、洗剤treのための条件を最適化することでした救出無鞭毛の生存率への影響を最小限に抑えながらTHP1細胞のほぼ完全な溶解をもたらすatmentは、 図1は、完全なアッセイプロトコールの顕微鏡図を示す。 リーシュマニア無鞭毛に感染無傷THP1細胞を図1Aに見ることができます。 図1Bは、界面活性剤処理後のTHP1細胞の溶解を、 図1Cは、部分的に前鞭と図1Dに変換された救出リーシュマニア無鞭毛は、中に無鞭毛のほぼ完全な変換を展覧前鞭およびその後続の増殖。これらの形質転換前鞭の成長を定量的alamarBlueの添加とマイクロプレートリーダーで蛍光の測定を使用して監視できます。 NP-40（ 図2A）およびTriton X-100（ 図2B）を用いた治療は、感染したTHP1細胞を溶解しますが、それはまた、生存能力に影響を与えたと救出無鞭毛の転換。ツイーン20（ 図2C）およびTween 80（ 図2D）を用いた治療は、形質転換された前鞭の低い数字によって示されるように無鞭毛の不完全な救助に結果THP1細胞の最適な溶解を起こさなかった。 30秒（ 図2E）、0.05％SDSを用いた治療では、 リーシュマニア感染THP1細胞のほぼ完全な溶解をもたらしたと救出無鞭毛の生存率および変換に影響を及ぼさなかった。さらなる最適化は、SECが実行可能なリーシュマニア無鞭毛（ 図2F）の最高救助をもたらした20から30、0.05％SDSを用いた細胞のその治療を示した。その後の実験では、30、0.05％SDSを用いた治療は秒が使用されました。 SDSの治療のための手順は、単一または複数のプレートでも同じです。複数のプレートには、SDS処理はマルチチャンネルピペットで列ごとに実装されました。無血清培地は、全8プレートの1列のウェルと20＆ムーから削除されました、0.05％SDSのlは同じ列の8ウェルで添加し、10％FBSを含むRPMI-1640で30秒後に希釈した。アッセイの初期の標準化の間に、プレートは非内在化前鞭を顕微鏡でチェックした。 5洗浄液の最小値は、標準化合物と3回の洗浄で感染マクロファージ細胞の治療のステップ5の前に寄生虫の除去のために必要であったSDSの治療のステップ7の前に必要であった。このように、細胞を8回洗浄し、目に見える非内在化前鞭は、感染したTHP1細胞の制御溶解前に残っていなかった。 デジタル画像解析と直接計数 リーシュマニア感染THP1細胞のデジタル画像は、（ 図3 SYBR Green Iを用いた染色特性キネトプラストDNAによるマクロファージの核と細胞内リーシュマニア核の両方が蛍光フィルターで観察した後にニコンエクリプス90I蛍光顕微鏡で捕獲された）。さらに、感染したTHP1細胞の画像もDIC下に捕獲された。両方のイメージがマージされたときに、細胞内の無鞭毛を持つTHP1細胞の輪郭が（ 図4）をより明確に見られた。 ImageJのソフトウェアは、これらの画像を分析するために使用された。 ImageJは国立衛生研究所（で開発パブリックドメイン、Javaベースの画像処理プログラムであるhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ）。 ImageJはJavaプラグインと記録可能マクロを介して拡張性を提供するオープン·アーキテクチャで設計されています。カスタム収集、解析および処理プラグインはImageJのビルトインエディタとJavaコンパイラを使用して開発することができます。 ImageJのでTHP1細胞核および寄生虫の核のカウント差のために、画像はImageJの年にオープンしました。セルカウンタは、ソフトウェアのプラグインで解析オプションで発見された。画像は初期化され、セルカウンタータイプ1はTHP1 cに選ばれましたエル核と細胞カウンタータイプ2は寄生虫核（ 図3）に選ばれました。差のカウントは少なくとも200 THP1細胞核及びこれらTHP1細胞核内に存在する細胞内無鞭毛のために行われました。寄生虫レスキューアッセイおよび画像解析法の比較は別のマクロファージとTHP1細胞の感染性を評価するために作られました。前鞭毛比：前鞭比（ 図4）図5は、別のマクロファージでTHP1細胞で差感染性を表します。どちらの方法でも同等の結果とマクロファージが認められた：1:10前鞭毛の比率が最適かつ再現性の感染性をもたらした。 parasite-rescue/transformationアッセイおよびデジタル画像解析のための条件が最適化された後、これらのアッセイの有用性は、抗リーシュマニア薬スクリーニングのために評価した。 リーシュマニア感染THP1細胞は、規格の異なる濃度で処理したすなわちNTI-リーシュマニア薬アムホテリシンB、24〜96時間の範囲の異なる時間間隔のペンタミジンとミルテフォシン。寄生虫の実験は、/形質転換試験は三重で行われた救出し、計数法直接細胞の実験は二重に行った。 図6は、未処理およびリーシュマニア感染感染感染していない、コントロールが、THP1細胞を処理した対照の顕微鏡画像を示す。用量反応曲線は、寄生虫の救助や形質転換試験（形質寄生虫対薬物の濃度）と画像解析アッセイ（amastigotes/100 THP1細胞の数）（図7-9）から調製した。薬剤のIC 50は ExcelFitによって計算し、 表1に示されている。デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイは、同等の結果を示した。デジタル画像解析ダイレクトカウンティング-Assayは、24および48時間薬剤tの初期の時点の間が最適であったreatments、パラサイト·レスキューフォーメーションアッセイは、薬剤処理後24から96時間の間に全ての時点で報告された値とより一貫性のある結果を示した。デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイによる結果の違いは、デジタル画像解析ダイレクトカウンティングにおける薬物治療の初期の期間中に非現実的な無鞭毛の存在が原因である可能性がありアッセイ。 図1： ドノバンリーシュマニアの顕微鏡ビューは前鞭への救助や変換を無鞭毛。 – リーシュマニア無鞭毛に感染付着THP1細胞、B -制御された溶解Cの後付着、感染THP1細胞-感染THP1マクロファージ細胞Dから救出無鞭毛からドノバンリーシュマニアの前鞭を一変- TRANの成長と増殖sformed ドノバンリーシュマニアの前鞭。 別の洗剤でリーシュマニア感染 THP1細胞から無鞭毛のTHP1細胞と救助の溶解の図2。前鞭にライブドノバンリーシュマニアの無鞭毛とその変換の最大救助を達成するために感染したTHP1細胞の制御された溶解の最適化分析。洗剤の2つの濃度（0.05％及び0.1％）と治療のための2つの期間（30秒、60秒）を試験した。 RFU =相対蛍光単位。各バーは、重複観測値の平均を表しています[A]は 、NP-40治療はTHP1細胞の溶解を引き起こし、また救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えた。[B]のトリトンX-100 treatmentはTHP1細胞の溶解を引き起こし、また救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えた[C]のTween 80は無鞭毛を救出するTHP1細胞の部分的な溶解を引き起こした[D]のTween 80は無鞭毛を救出するTHP1細胞の部分的な溶解が発生していました。【E 】SDS処理はTHP1細胞のほぼ完全な溶解を引き起こし、0.05％/ 30秒で救出無鞭毛の生存率に影響を及ぼさなかった。【F 20から30、0.05％SDSで]治療秒THP1細胞のほぼ完全な溶解を引き起こし、生寄生虫を救出前鞭に変身する無鞭毛。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図3 Leishmani in vitro で感染し、分化THP1細胞の蛍光デジタル画像ドノバンの無鞭毛。特性kDNAも各寄生虫の核と見られる場合があります。マクロファージの核（MN）（1）および寄生虫の核（PN）（2）感染症の定量的評価のために、ImageJの解析ソフトウェアで差動でマークされ、差動でカウントすることができます。定量はamastigotes/100 THP1細胞数として行われました。 図4デジタル画像解析ダイレクトカウンティング·アッセイ（下のパネル）と寄生レスキュー変態アッセイ（上段）との比較。マクロファージ：1:10前鞭毛の比率が最適な感染をもたらした。どちらも、同等の結果を示した。寄生虫レスキューアッセイは、いくつかのバックグラウンド値を示した。各バーのショーでは、重複値の平均。 <img alt="図5" src = "/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg" /> 図5異なるTHP1によってリーシュマニアに感染前鞭THP1細胞：前鞭毛型比。 amastigotes/100 THP1細胞数などの定量的な結果を図4に示されている。 図6：異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬による治療後ドノバンリーシュマニアの無鞭毛に感染THP1細胞のデジタル画像（蛍光灯+ DIC）。 結果はamastigotes/100 THP1細胞数として定量化と未処理のコントロールと比較して％の成長率を計算し、IC 50値を決定するために使用された。 <img alt="図7" fo：コンテンツの幅= "4.75in"のfo：srcは= "SRC" > 図7：抗リーシュマニア薬スクリーニング（Amophotericin B）のデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図8のためのデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較NTI-リーシュマニア薬スクリーニング（ペンタミジン）。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図9抗リーシュマニア薬スクリーニング（Mitefosine）のデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 試験薬物 24時間 48時間 72時間 96時間 IACA B PRTA C IACA B PRTA C IACA B PRTA C IACA B PRTA C アムホテリシンB 0.24±0.03 0.17±0.01 * 0.12±0.04 0.20±0.07 0.06±0.01 0.06±0.01 0.11±0.03 0.10±0.03 ペンタミジン > 10 2.55±1.16 * 2.88＆PLusmn; 0.58 1.43±0.91 1.24±0.35 1.52±0.16 0.71±0.63 0.98±0.33 ミルテフォシン 0.38±0.02 0.19±0.08 * 0.24±0.06 0.30±0.08 0.36±0.02 0.16±0.06 0.21±0.15 0.17±0.10 表1デジタル画像解析ダイレクトカウンティングアッセイおよび抗リーシュマニア薬スクリーニングのための寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。値がExcelfit（ 図7-9）により用量応答曲線から計算したIC 50（μg/ ml）の時間後に薬物治療; ます b IACA =画像解析と直接計数アッセイ; C PRTA =寄生のRescue and形質転換試験。与えられた値は、μg/ mlのようにIC 50（寄生虫成長の50％阻害を引き起こす薬物の濃度）であり、少なくとも3つの実験の平均値±SDである。 * IACAとIC 50値と比較して（<0.05）は統計学的に異なる。