Antileishmanial筛选对细胞内的寄生虫救援和转化实验<em>杜氏利什曼原虫</em无鞭毛体在THP1人急性单核细胞白血病细胞株

两个数字图像分析直接计数检测和的寄生虫救援转型含量进行了定量分析为24，48，72和96小时后药物治疗在直接计数法，感染L.原虫感染的巨噬细胞（THP1细胞）是由下面的等式计算： 无鞭毛体（通过无鞭毛体细胞核计数确定）/ 100转化THP1细胞（确定在THP1细胞核计数计数）（ 图7）是更准确的测量，分析不同的标准或试验化合物的影响比受感染的THP1细胞的百分比，以前的一些论文中所报告的，因为这个数字是直接关系到整体效果的化合物，无论是通过减少计算寄生在巨噬细胞或巨噬细胞cells.Infection总去除寄生虫感染的不同稀释度的不同的时间间隔（ 图10和表1）与不同的标准药物治疗在THP1细胞从数字图像。读出的数字图像分析直接计数-含量无鞭毛体infection/100转化THP1细胞，而读出的寄生救援-转化-含量的时间是相对荧光单位（RFU），这是获救从感染的巨噬细胞的活利什曼原虫的无鞭毛体的数目成正比，并变换成前鞭毛体。经常使用的AlamarBlue检测利什曼原虫前鞭毛体的反leishmanial药物筛选。 该法最初是规范和优化控制利什曼原虫感染的THP1细胞裂解。其目的是要优化的条件用于洗涤剂特雷atment，收率​​THP1细胞几乎完全溶解的影响最小获救的无鞭毛体的可行性。 图1示出了完整的检测协议的微观图。完好无损THP1细胞感染利什曼原虫的无鞭毛体，可以看到在图1A，图1B示出的洗涤剂处理后THP1细胞裂解。 图1C示出获救利什曼原虫无鞭毛体，其中部分已被转化为前鞭毛体和图1D示出了几乎完全转化的无鞭毛体进入前鞭毛体，并随后将其增殖。这些转化的前鞭毛体的生长可以定量监测与添加的AlamarBlue和测量的荧光酶标仪。治疗与NP-40（ 图2A）和Triton X-100的（ 图2B）裂解感染THP1细胞，但是，它也影响的生存能力和获救的无鞭毛体的改造。含吐温20（ 图2C）和吐温80（ 图2D）的处理没有引起导致到一个不完整的无鞭毛体救援THP1细胞，如转化的前鞭毛体的低的数字所表示的最佳的溶解。治疗与0.05％SDS，30秒（ 图2E），得到几乎完全裂解Leishmania感染THP1细胞，并没有影响获救无鞭毛体的可行性和改造。进一步的优化表明，处理过的细胞用0.05％SDS的20-30秒得到可行的利什曼原虫的无鞭毛体（ 图2F）的最高救援。在随后的实验中，用0.05％SDS的治疗，持续30秒。 SDS处理的程序是相同的单个或多个板。在多板，SDS处理实施柱柱多道移液器。除去无血清培养基中，从板的一列的所有8个孔的20＆亩; l的0.05％SDS的溶液中加入的同一列中的8个孔中，并与10％FBS的RPMI-1640稀释，在30秒后。测定初始标准化的期间，将板非内化的前鞭毛体在显微镜下检查。至少五个洗涤是必要的以除去寄生虫感染的巨噬细胞与标准化合物和洗涤三次SDS处理的步骤7的前有必要的治疗在步骤5之前。因此，将细胞洗涤8次，并没有可见的非内化的前鞭毛体保持在控制感染THP1细胞裂解之前。 数字图像分析和直接计数的数字图像捕获Leishmania感染THP1细胞有关Nikon Eclipse的90I荧光显微镜下观察与特征动质体DNA的荧光过滤器这两种巨噬细胞的细胞核和细胞内的利什曼原虫细胞核染色后用SYBR Green I.（ 图3）。另外，摄影图像的感染THP1细胞也被下拍摄DIC。当两个图像的合并，THP1细胞与细胞内的无鞭毛体的轮廓更清楚地看出（ 图4）。的的ImageJ软件，用来分析这些图像。 ImageJ是一个公共领域的，基于Java的图像处理程序在国家机构的健康（ http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ）开发的。 ImageJ的设计已通过Java插件和录制的宏提供了可扩展的开放式架构。自定义的采集，分析和处理插件，可开发利用ImageJ的内置的编辑器和Java编译器。对于差分计数的THP1细胞的细胞核和寄生虫核的ImageJ的，图像被打开了ImageJ的。细胞的计数器被发现在分析选项的软件插件。图像进行初始化和细胞计数类型被选定为THP1Ç埃尔细胞核和细胞计数器类型2被选择的寄生虫核（ 图3）。做了至少200 THP1细胞的细胞核和细胞内的无鞭毛体，THP1细胞的细胞核中存在的这些差异点票。寄生虫救援法和图像分析方法比较了具有不同的巨噬细胞的前鞭毛体的比例（ 图4）用于评估THP1细胞的感染性， 图5表示的差分THP1细胞中的感染，在不同的巨噬细胞：前鞭毛虫比率。两种方法都显示，可比的结果和巨噬细胞：前鞭毛虫的比例为1:10，取得了最佳的和可重复的感染力。 一旦条件parasite-rescue/transformation法和数字图像分析进行了优化，该实用程序的这些测定评价为反leishmanial药物筛选。 利什曼原虫感染的THP1细胞用不同浓度的标准一NTI-leishmanial药物，即两性霉素B，喷他脒和不同的时间间隔为24至96小时，米替福新。实验寄生虫救出/转化试验中，一式三份进行，并直接细胞计数法进行一式两份的实验， 图6示出了控制感染，控制感染未处理和利什曼原虫感染，治疗THP1细胞的显微镜图像。的剂量响应曲线，从寄生虫救援和转化实验（对比转化寄生虫药物的浓度）和图像分析测定（amastigotes/100 THP1细胞的数目）（图7-9）中制备。的药物的IC 50分别计算通过ExcelFit和列于表1中。数字图像分析直接计数检测和寄生虫救援转型含量的显示，可比的结果。数字图像分析直接计数法得到优化的较少，在早期时间点的24小时和48小时药物吨reatments，而寄生救援转型检测结果显示结果更符合报告的值在所有的时间点在24-96小时后，药物治疗。结果与数字图像分析直接计数检测和寄生虫救援转型含量的差异可能是由于存在非可行的无鞭毛体在早期的药物治疗期间的数字图像分析直接计数 – 检测。 图1。显微镜观察杜氏利什曼原虫无鞭毛体救援和改造前鞭毛体。 A -贴壁THP1细胞感染了利什曼原虫无鞭毛体; B -贴壁，受感染的THP1细胞，在控制裂解Ç -救出感染THP1巨噬细胞的电池D的无鞭毛体转化杜氏利什曼原虫前鞭毛体-细胞生长和增殖的转录sformed 杜氏利什曼原虫前鞭毛体。 图2。优化的控制感染的THP1细胞裂解，以实现最大的救援现场杜氏利什曼原虫无鞭毛体和转型前鞭毛体。THP1细胞和救援的无鞭毛体，从不同的清洁剂利什曼原虫感染的 THP1细胞裂解分析。两个的洗涤剂的浓度（0.05％和0.1％）和两个时间周期（30秒和60秒），用于治疗进行了测试。 RFU相对荧光单位。每个酒吧的平均重复观测。[A] NP-40治疗引起的THP1细胞裂解，也影响了获救的无鞭毛体寄生虫的可行性。[B]的Triton X-100疗程NT引起的THP1细胞裂解，也影响了获救的无鞭毛体寄生虫的可行性[C]吐温80的THP1细胞引起的部分裂解抢救无鞭毛体。[D]吐温80的THP1细胞引起的部分裂解抢救无鞭毛体。[E [SDS处理几乎完全裂解引起的THP1细胞获救的无鞭毛体的可行性，并没有影响在0.05％/ 30秒[F] 20-30秒，0.05％SDS的治疗造成了几乎完整的THP1细胞裂解，并救出可行的寄生虫无鞭毛体转化为前鞭毛体。 点击此处查看大图 。 图3。荧光数字图像的分化的THP1细胞在体外感染Leishmani原虫无鞭毛体。也可以看出的特征kDNA与每个寄生虫核。巨噬细胞的核（MN）（1）和寄生虫核（PN）（2）差异标记和差分计数ImageJ的分析软件进行定量评价的感染。定量的amastigotes/100 THP1细胞数。 图4。比较数字图像分析直接计数含量（下图）和寄生虫救援转型含量（上图）。的巨噬细胞：前鞭毛虫之比为1:10，得到最佳的感染。这两个人都表现出类似的结果。救援的寄生虫检测结果显示一些背景值。每个栏显示重复值的意思。 <img alt="图5" src ="的“/" filesftp_upload40544054fig5.jpg”> 图5。THP1细胞感染利什曼原虫前鞭毛体由不同THP1：前鞭毛虫比。作为amastigotes/100 THP1细胞数的定量结果在图4中给出。 图6。数字图像（从萤光灯+ DIC）的THP1细胞感染利什曼原虫无鞭毛体与标准的反leishmanial药物治疗后不同的时间段。 结果进行了量化的作为中的amastigotes/100 THP1细胞数，并用于计算％的增长，与未处理的对照组相比，确定IC 50值。 <img alt="图7" fo内容宽度="“4.75in”佛：SRC" > 图7。比较数字图像分析直接计数检测和寄生虫救援转型为的反leishmanial药物筛选（Amophotericin B）的测定。治疗感染的巨噬细胞与不同浓度的标准抗leishmanial药物的不同时期。 IC 50值（微克/毫升）计算出的剂量反应曲线Excelfit。 点击此处查看大图 。 数字图像分析直接计数检测和寄生虫救援转型含量的比较图8。的药物筛选NTI-leishmanial（喷他脒）。治疗感染的巨噬细胞与不同浓度的标准抗leishmanial药物的不同时期。 IC 50值（微克/毫升）计算出的剂量反应曲线Excelfit。 点击此处查看大图 。 图9比较数字图像分析直接计数法和反leishmanial药物筛选（Mitefosine）的寄生虫救援转型含量。被感染的巨噬细胞分别用不同浓度的标准的反leishmanial药物不同的时间段。从Excelfit的剂量响应曲线计算IC 50值（微克/毫升）。点击这里查看大图 。 测试药物 24小时一 48小时一 72小时一 96小时一 IACA b PRTAÇ IACA b PRTAÇ IACA b PRTAÇ IACA b PRTAÇ 两性霉素B 0.24±0.03 0.17±0.01 * 0.12±0.04 0.20±0.07 0.06±0.01 0.06±0.01 0.11±0.03 0.10±0.03 喷他脒 > 10 2.55±1.16 * 2.88和PLusmn 0.58 1.43±0.91 1.24±0.35 1.52±0.16 0.71±0.63 0.98±0.33 米替福新 0.38±0.02 0.19±0.08 * 0.24±0.06 0.30±0.08 0.36±0.02 0.16±0.06 0.21±0.15 0.17±0.10 表1的数字图像分析直接计数检测和寄生虫救援转型含量为的反leishmanial药物筛选。治疗感染的巨噬细胞与不同浓度的标准抗leishmanial药物的不同时期。从剂量反应曲线计算的IC 50值（微克/毫升） 一个小时后的药物治疗，B IACA =图像分析和直接计数者Excelfit（ 图7-9）。含量，C PRTA寄生虫救援和转化实验。所给出的值是为微克/毫升的IC 50值 （引起50％抑制寄生虫的生长的药物的浓度）是至少三次实验的平均值±SD。 *显着性差异（P <0.05）相比，IC 50值IACA。