Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

1. 결정화 플레이트 준비 robotically 결정 시험을 수행하도록 설정하면 인용 발명 2에 자세히 설명 유리 샌드위치 결정 플레이트 (그림 2)의베이스 플레이트의 준비를 시작합니다. 베이스 플레이트가 먼저 silanized해야하며 우물을 만들고 구멍을 두 번 스틱 스페이서는, 판에 적용해야합니다. 이 필요한 자료 및 물품은 재료에 따라 세분화되어 있습니다. 종이 타월에 판을 놓고 솔루션을 silanizing의 몇 방울을 적용하고 종이 티슈로 판 표면에 균등하게 배포 할 수 있습니다. 물을 비커에 금속판을 immersing하여 초과 silanizing 솔루션을 제거합니다. 비커의 판을 꺼내, 드라이 종이 타월, silanized면에 게재 할, 그리고 종이 수건으로 가볍게 닦고함으로써 노출 된 표면을 건조. 구멍을 두 번 스틱 스페이서에 보호 커버 보지그리고 유리 접시의 건조, silanized 표면에, 스페이서, 끈적한면을 아래로 적용됩니다. 스페이서가 상단 왼쪽 코너와 스페이서의 두 개의 인접한면과 일치하는 판과,베이스 판에 제대로 위치되어 있는지 확인합니다. 베이스 판에 스페이서를 평평하게하고 그들 사이의 방수 밀봉을 만들 롤러 또는 brayer을 사용합니다. 사전 조립 된 접시는 (; MD11-55-100, 분자 크기 및 LCP96T – UVP70U, Swissci HR3-151, 햄튼 연구) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 비용상의 이유로, 우리는 위의 프로토콜에 따라 우리 자신의 접시를 구성하는 것을 선호합니다. 2. Meso 로봇 1 이 비디오 문서에 입증 할 meso 로봇의 첫 번째는 현재 MS & FB 그룹 (그림 3)에서 사용되는 하나입니다. 로봇의 전체 내용은 재료에서와 참조 섹션 5에서 찾을 수 있습니다. 자료 및 equipmeNT는 재료에 따라 세분화되어 로봇을 사용하여 결정화 재판을 설정이 필요합니다. 로봇의 갑판에서 제 1 준비 스페이서와베이스 플레이트를 배치합니다. 그곳은 기지 판 정렬의 목적을 위해 잘 위치가 표시 자체 플랫폼이 있습니다. 플레이트는 식별 목적으로 표시해야합니다. 결정화 판 옆에있는 로봇의 갑판에서 자신의 플랫폼에서 96 – 웰 침전제 블록을 고정합니다. 플라스틱 실링 캡을 벗겨으로 조심스럽게 블록을 엽니 다. 가습기를 켜고 로봇의 갑판에서 바닥 판 이상에서 습한 공기의 흐름을 지시. 가습기는 침전제 솔루션의 증발을 감소하고 결정 판 5에서 재현성을 향상시키기 위해 표시되었습니다. 그것은 mesophase의 분배가 개시 직전, 그렇지 않으면 주위 상대 습도가 낮은 상태에서이 지역을 미리 …을 축이다, 또는 이전에 ON으로 설정 – 업 설정할 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 로봇을 초기화합니다. 정확한 절차가 시간이 지남에 따라 변화하기 때문에 악기 별 안내는 어떠한 자세히 여기에 설명되지 않습니다. 기본적으로, 어떻게 초기화하는 동안 발생하면 로봇에 팔을 분배 mesophase의 세 가지 직교 방향으로 X, Y 및 Z '의 기준 위치와 함께 제공된다는 점입니다 로봇의 팔 1 (그림 3)에, 바늘을 분배 완비, 해밀턴 주사기에 단백질을이고 mesophase을 첨부합니다. 주사기로를로드 mesophase 방법과 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 참고 자료 3,7-10에 설명되어 있습니다. 결정화베이스 판에 스페이서에서 상부 보호 덮개를 제거하고베이스 플레이트 플랫폼에서 fiducials있는 판에있는 우물을 맞 춥니 다. 참고이 동영상의 목적, 보호 커버가 정렬 단계에서 뷰어를 지원하기 위해 자리에 남아되었다. 분배 syring의 바늘 끝을 정렬결정화 플레이트 (자 A1)의 왼쪽 모서리에 잘 맨 하단에있는 전자. 이것은 바늘 끝이 잘의 맨 아래에 있습니다 얼마나 가까운 보면서 분배 팔의 높이 또는 Z-좌표를 조정 눈으로 이루어집니다. 팁 그냥 잘의 하단을 터치 있다는 것은 분배 팔의 높이를 조정 아무리 약간하면서 플랫폼에서 좌우로 판을 이동하여 판단 할 수 있습니다. 컴퓨터에 팁 연락처 판 분배 팔의 Z 좌표를 입력합니다. 분배이 80 마이크로 미터이 참조베이스 플레이트의 표면에 해당하는 Z-위치에서 바늘 끝으로 자리를 차지하도록 프로그래밍되어 있습니다. 눈 잘 A1의 중앙에 바늘 끝의 위치. 제어 컴퓨터 참조 X, 팁이 중심 분배 팔 Y 좌표에 저장합니다. 이 좌표는 접시에 남아있는 우물의 중심을 정의하는 데 사용됩니다. PR신선한 mesophase을 보장하기 위해 로봇 컴퓨터에 적절한 명령을 사용하여 IME 주사기 분배 바늘과 첫 번째 및 그 이후의 우물이 mesophase 자신의 전체 보완을받을 수를 채 웁니다. 조직과 바늘 끝에 압출 mesophase을 닦아주십시오. 로봇의 팔 2 침전제 분배 팁을 세척하고 침전제 블록에서 솔루션을 기음 할 준비가되어 단계를 플러싱의 라운드를 시작하는 실행 로봇 (X-AP) 프로그램을 시작합니다. 활성화 움직임에 침전제 솔루션 (보통 800 NL)에 이어 첫번째 단백질 라덴 mesophase (보통 50 NL), 한 번 8 우물의 열과 우물의 순차적 로딩을 설정할 수있는 로봇에 기능을 투여.에게 로드 열 사이에, 바늘의 끝은에 배치되어있는 주차 위치로 mesophase 분배 암 반환 아웃 건조에서 끝에서 mesophase을 방지하기 위해 스펀지를 moistened. 분배 mesophase와 침전제의 과정은 반복된다판에 걸쳐 11 시간 플레이트는 가득 될 때까지. mesophase와 침전제로 96 – 웰 플레이트의로드를 완료하는 데 5 분 정도 소요됩니다. 접시가 가득하고 로봇 팔이 공원의 위치로 돌아 즉시, 로봇의 갑판에서 판을 제거하고 평평한 고체 표면에 놓으십시오. 즉시 잘 구성의 시간에 따라 달라 변경 사항을 최소화하기 위해 커버 유리로 판을 밀봉. 이 커버 유리는베이스 플레이트와 광장 정렬 및 커버 유리의 아무도는베이스 플레이트의 면적 넘어 확장되지 않으니, 모든 96 우물이 완전히 적용되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 롤러 또는 brayer는 커버 유리와 스페이서 사이의 강함과 균일 한 인감을 만드는 데 사용됩니다. 가 제대로 설정이 올라가 확인하기 위해 판을 검사합니다. 어떤 사람이 찾고 것은 각도에 등장하는 '팬에 튀긴 계란'이다. 튀긴 계란의 노른자는 mesophase에 해당합니다. 계란의 흰색은 침전제 soluti입니다와 팬의 가장자리가 잘 결정의 경계입니다. 이상적으로, 셋은 동심입니다. 크리스탈 성장을위한 온도 조절 저장 영역에있는 접시를 놓습니다. 더 이상 접시가 설정 할 수없는 경우, 로봇의 갑판에서 침전제 블록을 제거 단단히 그것을 밀봉하고 창고로 돌아 넣어. 로봇의 분배 팔에서 mesophase가 포함 된 주사기를 제거를 해체하고, 다음 사용을위한 준비 메탄올 건조를주의 깊게 분배 바늘과 페럴 등의 부품을 씻는다. 3. Meso 로봇이합니다. 모기 LCP 모기 LCP 로봇 (그림 4) 로봇 (1)에 의해 사용하는에 유사한 mesophase 디스펜서을 포함한다. 로봇 1 대조적으로, 그것은 일회용 팁에 의해 침전제 dispenses. 프로그래밍 소프트웨어는 특정 결정화 접시 precipit 작업에 악기를 설정하는 데 사용됩니다개미 블록, 및 지정된 순서대로 me​​sophase와 침전제의 사용자 정의 볼륨을 투여합니다. 이러한 내용은 제조업체가 제공되며, 여기에 설명되지 않습니다. 로 로봇 1 아래와 목성의 기사 1712 1 위의 설명에 바늘로 완전하고 단백질을이고 mesophase로 가득 해밀턴 주사기를 준비합니다. 로봇의 분배 팔에 위치에 주사기를 고정. 데크를 사용 X 및 분배 주사기에 바늘의 Y 좌표를 설정하기 위해 레이저 센서를 장착. 이 mesophase이 판의 각 우물의 중앙에 정확하게 투여되어 있는지 확인하는 데 필요한 중요한 단계입니다. 제어판에있는 버튼의 터치와 함께 주요는 주사기 바늘에서 mesophase를 배출합니다. 우물을로드하는 로봇을 사용하기위한 준비 조직과 바늘 끝에서 압출 mesophase를 제거합니다. 로봇 습한의 갑판에 결정 플레이트를 삽입하기 전에모세관 현상에 의해 장소에서 접시를 개최하는 데 도움이 물 몇 방울과 플랫폼의 표면 ko 페이지를 참조하십시오. 유리베이스 판에 스페이서에서 보호 커버를 제거하고 좋은 준수를 보장하기 위해 단단히 플랫폼에 배치. 이를 분배 바늘 팁에 대해 접시에 우물의 적절한 위치를 확보 3 코너 우물을 정렬하기 위해 플랫폼에서 세 fiducials을 사용합니다. 악기는 이제 분배주기를 입력 할 명령입니다. 사이클은 mesophase은 신선한 mesophase과 우물을로드하는에 이동하기 전에 바로 작은 유리 플레이트에 투여 된 제 2 프라이밍 단계를 시작합니다. 다음 로봇 첫째 mesophase 판 8 우물의 수직 열이로드하고 mesophase bolus 상단에 침전제 솔루션을 투여 할 수있는 일회용 팁을 사용합니다. 모든 우물이 가득 될 때까지 과정은 판의 길이를 따라 11 번 반복됩니다. 전체 과정을 완료하는 데 약 5 분 정도 소요됩니다. 삭제가득 로봇의 플랫폼에서 플레이트와 로봇 1 아래 위에서 설명한대로 커버 유리로 밀봉. 크리스탈 성장을위한 온도 제어 된 환경에서 제대로 표시, 접시를 놓습니다. 4. Meso 로봇 3에서. Gryphon LCP Gryphon LCP 로봇 (그림 5) 로봇 1, 2 위 설명 할 수있는 유사한 mesophase 분배 시스템을 포함한다. 어떤 다른 두에서 구별하면 모든 96 침전제 솔루션은 동시에 투여하는 것입니다. 단백질을이고 mesophase을 준비하고 로봇 1, 2에서, 위에 설명 된 바와 같이, 분배 주사기에로드하고, 주피터 문서에 1,712 1. 로봇의 분배 팔에 위치에 주사기를 고정. 로봇의 갑판에 침전제 솔루션 블록 및 결정화 판을 놓습니다. 96 팁 hea로드침전제 솔루션 개발. 사용자 정의 지연 시간은 점성 precipitants을 aspirating 촉진하기 위해 제공된다. 분배 사이클을 입력 악기를 지휘. 사이클은 mesophase이 완료 약 1 분 소요 프로세스에서 96 우물에 순차적으로 투여되고 시작됩니다. 96 팁 머리는 결정 우물에서 mesophase boluses의 상단에 한 번에 모든 96 침전제 솔루션을 dispenses. 전체 판 로딩 과정은 2 분에 완료되었습니다. 로봇의 플랫폼에서 채워 판을 제거하고 로봇 1 아래 위에서 설명한대로 커버 유리로 밀봉. 크리스탈 성장을위한 온도 제어 된 환경에서 제대로 표시, 접시를 놓습니다. 5. 대표 결과 이 비디오 문서의 목적은 점성, 유리 sandwic의 막 단백질을이고 mesophase 자동으로 결정화 실험을 설정하는 방법을 보여주기 위함이다H 96 – 웰 결정 판. 강조 최소한의 수동 개입을 필요로 전문 로봇의 사용을 통해 자동화에 있습니다. 로봇이 사용될 때 mesophase와 침전제 투여와 잘 내 두의 위치의 볼륨의 측면에서 재현성과 정밀성이 예상된다. 이러한 crystallogenesis을 지원하는 조건의 효율적인 심사의 관점에서 중요합니다. 또한 영상 장비를 자주 수행 크리스탈 성장을 평가하는 것입니다 분석 파이프 라인의 다음 단계에 대한 중요합니다. 떨어 뜨리거나 bolus 위치는 이미징 프로세스의 핵심이며, 우물에 bolus의 불규칙하고 부적절한 위치가 보통을 위해 해결하기 위해 사용자 개입이 필요하고 시간이 걸립니다. 그림의 목적 상, 제대로하고 부적절하게로드 플레이트의 예는 그림 6에 표시됩니다. 그림 1. 순서도는 meso-재배 막 단백질 결정의 생산, 수확 및 cryo 냉각하는 단계를 요약 한 것입니다. 점선 빨간색 선으로 둘러싸인 단계는이 목성 기사의 초점입니다. 로봇이 단계 29-32에 mesophase와 침전제 솔루션을 분배하는 데 사용되었습니다. 인용 발명 3에서. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 2. 완전히로드와 봉인 96 – 웰 유리 샌드위치 결정 판. 각각의 잘 50 NL 입방 단계 1 μl 침전제 솔루션이 포함되어 있습니다. 명확성을 위해, 입방 단계는 수단 레드 물들과 침전제 솔루션은 메틸렌 블루를 포함하고 있습니다. 인용 발명 5에서. _upload/4000/4000fig3.jpg "ALT ="그림 3 "/> 그림 3. meso 로봇 (로봇 1). 로봇은 두 팔을 수 있습니다. 무장 1 dispenses 단백질을이고 lipidic mesophase합니다. 무장 2 침전제 솔루션을 dispenses. 충전 중에는 96 – 웰 플레이트는 자체가 고정되는 로봇의 갑판에서 위치에 고정 남아 있습니다. 두 팔이 mesophase와 침전제 솔루션을 제공하기 위해 이동합니다. 인용 발명 3에서. 그림 4. 모기 LCP 로봇 (로봇 2). 로봇 1, 96 – 웰 플레이트와 침전제 솔루션 블록을 앉아있는시 모기의 LCP의 갑판에 대조적으로, 충전하는 동안 수평으로 이동합니다. 그림 5. Gryphon LCP 로봇 (로봇 3). 중설정 lipidic 입방 상 디스펜서는 96 – 웰 플레이트에 단백질을이고 mesophase를 제공​​하기 위해 이동합니다. 데크는 침전제 솔루션 팁 머리를 접시의 위치를​​ 수평으로 변환합니다. 모든 96 침전제 솔루션은 동시에 투여합니다. 사진은 제조업체 (로부터 공급 http://www.artrobbins.com/ )와 표시. 그림 6. 완전히로드와 봉인 96 – 웰 유리 샌드위치 플레이트 (A)와 우물 제대로 (B)과 부적절 (C, D) meso 로봇 (로봇 1)를 사용하여 가득 찼다. 의 판에 바코드 레이블이는 판 보육 / 영상 장치에서 판을 추적하는 데 사용됩니다. 패널에서 BD, 침전제 솔루션과 mesophase는 각각 P와 M, 표시됩니다. 예상 '팬에 기름에 튀긴 계란'B에서 잘 모양이 제대로로드하고 잘 밀봉의 특징입니다. C에서, 침전제는 중심을 벗어난 위치에 잘 부적절한으로 투여되어 스페이서와 접촉했다. C에서는 mesophase의 볼륨이 있어야보다 덜하다고도 나타납니다. 침전제 솔루션을 통해 불완전로드의 예는 규모 D.에 표시되어, 모든 우물의 직경은 6mm입니다.