שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

1. הכנת צלחת ההתגבשות ההגדרה לעשות משפט התגבשות רובוט מתחילה בהכנת בסיס צלחת צלחת זכוכית כריך ההתגבשות (איור 2), שתוארה בפירוט בעיון 2. בסיס הצלחת חייבת להיות ראשון silanized וspacer כפול המקל המחורר שיוצר את הבארות, חייב להיות מיושם על הצלחת. את החומרים והציוד הדרושים לכך מפורטים בחומרים. מניח את הצלחת על מגבת נייר, חל כמה טיפין של silanizing פתרון ולהפיץ אותו באופן שווה על פני הצלחת עם מגבת נייר. הסר פתרון silanizing עודף ידי טבילת הצלחת בכוס מים. קח את הצלחת מהכוס, מניח אותו על נייר מגבת יבשה, צד silanized למעלה, ולייבש את המשטח החשוף שלה על ידי ניגוב קל עם מגבת נייר. לקלף את הכיסוי המגן על spacer המחורר, כפול המקלולהחיל את מרווח הצד, הדביק למטה, למשטח היבש, silanized של צלחת הזכוכית. הקפד שspacer ממוקם כראוי על בסיס הצלחת, עם הפינה השמאלית העליונה היד ושני הצדדים הסמוכים של spacer וצלחת, ביחד. השתמש ברולר או brayer כדי לשטח את spacer על בסיס הצלחת וליצור חותם חזק ביניהם. צלחות מראש התאספו זמינות מסחרי (HR3-151, המפטון מחקר; MD11-55-100, ממדים מולקולריים; וLCP96T-UVP70U, Swissci). מסיבות בעלויות, אנו מעדיפים להרכיב הצלחות שלנו בעקבות הפרוטוקול לעיל. 2. בMeso 1 הרובוט הראשון בטווה רובוט שהפגין במאמר זה וידאו הוא זה כעת בשימוש בMS & FB הקבוצה (איור 3). פירוט מלא של הרובוט ניתן למצוא תחת חומרים ובמדור ההדרכה 5. את החומרים והמכשורnt נדרש להגדיר משפט התגבשות באמצעות הרובוט מפורטים בחומרים. הנח את בסיס הצלחת עם spacer הכין בסעיף 1 על סיפונו של הרובוט. יש הפלטפורמה שלה המסומנת בעמדות גם למטרות של יישור בסיס צלחת. הצלחת צריכה להיות מתויגת למטרות זיהוי. אבטח את הבלוק 96-המזרז גם בפלטפורמה שלה על הסיפון של הרובוט לצד צלחת ההתגבשות. פתח את הבלוק בקפידה על ידי קילוף כובע איטום הפלסטיק. הפעל את מכשיר האדים ולהפנות את זרם האוויר לח מעל ומעבר לבסיס צלחת על סיפונו של הרובוט. מכשיר האדים הוכח כדי להפחית את האידוי של הפתרון הנמהר וכדי לשפר את השחזור פני צלחת ההתגבשות 5. זה יכול להיות מופעל לפני הגדרה מראש ללחלח את האזור כאשר הלחות יחסית הסביבה היא נמוכה, או בדרך אחרת, הרגע לפני הביטול של mesophase מתחיל. אתחל את הרובוט בהתאם להוראות היצרן. הוראות מכשיר ספציפיות לא תוארה כאן בכל פרט, כי נהלים מדויקים ישתנו עם זמן. בעיקרו של דבר, מה שקורה במהלך האתחול הוא שmesophase מחלק זרוע ברובוט מסופק עם עמדות התייחסות בשלושה כיוונים מאונכים X, Y ו-Z צרף mesophase חלבון העמוס במזרק המילטון, להשלים עם מחלק מחט, לזרוע של הרובוט 1 (איור 3). פירוט מלא של אופן הכנת mesophase ואיך לטעון אותו לתוך המזרק תואר כבר בהפניות 3,7-10. הסר את כיסוי המגן העליון מspacer על בסיס צלחת הגיבוש וליישר את הבארות בצלחת עם fiducials על פלטפורמת בסיס הצלחת. שים לב, במטרת הסרטון הזה, כיסוי המגן שנשאר במקום כדי לסייע המציג במהלך צעד היישור. יישר את קצה המחט של syring מהחלקדואר עם תחתית העליונה גם בפינה השמאלית של צלחת ההתגבשות (טוב A1). הדבר נעשה על ידי עין התאמת הגובה או Z-לתאם של הזרוע מהחלק תוך כדי הצפייה כמה קרוב קצה המחט מגיע לתחתית הבאר. שרק הקצה נוגע בתחתית הבאר אפשר לשפוט על ידי הזזת הצלחת מצד לצד בפלטפורמה תוך מעט שבמעט התאמת הגובה של הזרוע מהחלק. להיכנס למחשב Z-הקואורדינטות של זרוע מהחלק שבו קשר קצה הצלחת. נתינת עצות מתוכנת להתקיים עם קצה המחט 80 מיקרומטר מאזכור זה Z-עמדה אשר תואמת את פני השטח של בסיס הצלחת. מיקום על ידי עין קצה המחט במרכז ובכן A1. חנות במחשב שליטת X ההתייחסות, Y הקואורדינטות של זרוע מהחלק שבו את הקצה במרכזו. קואורדינטה זו משמשת להגדרת מרכז הבארות שנותרו על הצלחת. יחסי הציבורIME המזרק באמצעות הפקודה המתאימה במחשב הרובוט כדי להבטיח שmesophase הצח ממלא את מחט ניפוק וכי הבארות הראשונות ולאחר מכן תקבלנה השלמה המלאה שלהם mesophase. לנגב mesophase נמתח על קצה המחט בממחטת נייר. הפעל את תכנית הפעלת הרובוט (X-AP) ליזום סיבוב של שטיפת מדרגות שבו מחלק הטיפים הנחפזים על זרוע 2 של הרובוט הם שטפו ומוכנים לשאוב פתרונות מהגוש המזרז. הפעל את פונקציית לוותר על הרובוט להניע את הטעינה הרציפה של בארות עם mesophase חלבון עמוס (בדרך כלל 50 NL) הראשון, טור של שמונה בארות בכל פעם, ואחריו פתרונות נחפזים (בדרך כלל 800 NL). בין עמודי טעינה, חוזר זרוע מחלק mesophase לעמדת חניה שבו בסוף המחט ממוקם בספוג שהורטב כדי למנוע mesophase בקצה מההתייבשות. תהליך הניפוק mesophase והפזיז חוזר על עצמו11 פעמים על פני הצלחת עד הצלחת מלאה. הטעינה של צלחת 96 היטב עם mesophase ופזיז לוקחת 5 דקות כדי להשלים. ברגע שהצלחת מלאה ואת זרועות הרובוט חזרו לעמדותיהם בפרק, להסיר את הצלחת מהסיפון של הרובוט והנח אותו על משטח מוצק שטוח. באופן מיידי, לאטום את הצלחת עם כיסוי זכוכית כדי למזער את שינויי הזמן תלויים בהרכב טוב. חשוב להבטיח כי כל 96 הבארות מכוסות באופן מלא, שכיסוי הזכוכית מיושרת מרובעת עם בסיס צלחת ושאף אחד מכיסוי הזכוכית משתרעת מעבר לטביעת הרגל של בסיס הצלחת. רולר או brayer משמש ליצירה חזקה וחותם אחיד בין כיסוי הזכוכית וspacer. בדוק את הצלחת כדי להיות בטוח להגדיר הלך כמו שצריך. מה שמחפש הוא 'ביצה מטוגנת במחבת' בכל ההופעה טובה. החלמון של הביצה המטוגנת מתאים לmesophase. לבן של הביצה הוא soluti המזרזובקצה של מחבת ההיקף של ההתגבשות היטב. באופן אידיאלי, השלושה הם קונצנטרי. מכניס את צלחת אזור אחסון טמפרטורה מבוקרת לגידול גביש. אם אין יותר צלחות הן שיוקמו, להסיר את החסימה המזרזת מסיפון הרובוט, לאטום אותו היטב והחזיר אותו לאחסון. הוצא את המזרק המכיל mesophase מהזרוע מהחלק של הרובוט, לפרק אותו, ולשטוף את חלקיו, כולל מחט מחלק וטבעת חזוק, זהירות עם מתנול ויבש בתכשיר לשימוש הבא. 3. בMeso הרובוט 2. היתוש LCP יתוש LCP הרובוט (איור 4) משלב מנפק mesophase דומה לזה המשמש עד 1 ברובוט. בניגוד לרובוט 1, זה dispenses מזרז באמצעות טיפים חד פעמים. תכנות תוכנה משמשת כדי להגדיר את המכשיר לעבודה עם צלחות התגבשות מסוימות וprecipitלוקי נמלה, ולוותר כרכי משתמש מוגדר של-mesophase ופזיז ברצף שהוגדר. פרטים כאלה מסופקים על ידי היצרן ולא תארו כאן. הכן את מזרק המילטון, להשלים עם מחט ומלאה בחלבון mesophase העמוס, כפי שתואר לעיל תחת 1 רובוט ובמאמר יופיטר 1712 1. הצמד את המזרק בתנוחה על הזרוע מהחלק של הרובוט. השתמש הסיפון רכוב חיישן ליזר כדי לקבוע את קואורדינטות X ו Y של המחט על המזרק מהחלק. זהו צעד חשוב נדרש כדי להבטיח שmesophase הוא חלק במדויק במרכזו של כל גם על הצלחת. בלחיצה על כפתור בלוח הבקרה, ראש המזרק לגרש mesophase מהמחט. הסר mesophase נמתח מקצה המחט עם רקמה בהכנה לשימוש ברובוט כדי לטעון בארות. לפני הצבת צלחת ההתגבשות על הסיפון הלח הרובוטen פני השטח של הפלטפורמה עם כמה טיפין של מים כדי לעזור להחזיק את הצלחת במקום על ידי הנימיות. הסר את כיסוי המגן מspacer על בסיס צלחת הזכוכית ולמקם אותו על הפלטפורמה שלה בחוזקה על מנת להבטיח היצמדות טובה. השתמש השלוש fiducials על הפלטפורמה כדי ליישר את 3 בארות פינה ובכך להבטיח מיקום נכון של הבארות בצלחת בכל הנוגע לקצה המחט מהחלק. המכשיר עכשיו פקד להיכנס מחזור חלק. המחזור מתחיל בצעד שני שבו יחול mesophase הוא לוותר על צלחת זכוכית קטנה באופן מיידי לפני שעברה לטעינת בארות עם mesophase טרי. עומסי הרובוט הראשונים עם mesophase טור אנכי של 8 בארות בצלחת ולאחר מכן משתמשים בטיפים חד הפעמיים לפתרון נמהר לוותר על גבי בולוס mesophase. התהליך חוזר על עצמו 11 פעמים לאורכו של הצלחת עד שכל הבארות מלאות. כל התהליך לוקח בערך 5 דקות כדי להשלים. להסירצלחת המלאה מהפלטפורמה של הרובוט ולאטום אותו עם כיסוי זכוכית כמתוארת לעיל תחת 1 רובוט. הנח את הצלחת, עם תווית נכונה, בסביבה מבוקרת טמפרטורה לגידול גביש. 4. בMeso 3 רובוט. Gryphon LCP Gryphon LCP הרובוט (איור 5) משלב מערכת ניפוק mesophase דומה לזה שתואר לעיל עבור רובוטי 1 ו 2. מה שמבדיל אותו משני האחרים הוא שכל 96 הפתרונים נחפזים הם חלקו בו זמנית. הכן mesophase חלבון העמוס ולטעון אותו לתוך המזרק מהחלק, כמתואר לעיל, תחת 1 רובוטים ו2, ובמאמר יופיטר 1712 1. הצמד את המזרק בתנוחה על הזרוע מהחלק של הרובוט. הנח את בלוק הפתרון הנמהר וצלחת התגבשות על סיפונו של הרובוט. טען 96-טיפ heaד עם פתרונות נחפזים. זמן השהיה מוגדרת משתמש מסופק על מנת להקל aspirating מזרז צמיגה. שלוט במכשיר להיכנס למעגל מחלק. המחזור מתחיל בעובדה שספקה לך את mesophase רצף ל96 הבארות בתהליך שלוקח כ 1 דקות כדי להשלים. ראש 96-טיפ אז dispenses כל 96 הפתרונים הנחפזים בבת אחת על גבי את הפיתיונות המיובשים mesophase בבארות ההתגבשות. צלחת תהליך הטעינה כולו הוא סיים תוך 2 דקות. הסר את הצלחת המלאה מהפלטפורמה של הרובוט ולאטום אותו עם כיסוי זכוכית כמתוארת לעיל תחת 1 רובוט. הנח את הצלחת, עם תווית נכונה, בסביבה מבוקרת טמפרטורה לגידול גביש. 5. נציג תוצאות מטרתו של מאמר זה וידאו היא להדגים כיצד להגדיר באופן אוטומטי ניסויי התגבשות עם צמיג, mesophase קרום חלבון עמוס בזכוכית sandwicצלחות 96-H. גם התגבשות הדגש הוא על אוטומציה באמצעות השימוש ברובוטים מיוחדים הדורשים התערבות ידנית מינימאלית. שחזור והדיוק, במונחים של היקפי mesophase ופזיזים לוותר והמיקום של שניהם בתוך הבאר, צפויים כאשר רובוט משמש. אלה הם חשובים מנקודת מבט של הקרנה אפקטיבית בתנאים שתומכים crystallogenesis. הם גם חיוניים לצעד הבא בצנרת הניתוח היא להעריך שצמיחת גביש נעשתה לעתים קרובות עם ציוד הדמיה. מיקום טיפה או בולוס הוא מפתח לתהליך ההדמיה, ומיקום לא סדיר ותקין של בולוס בבאר בדרך כלל דורש התערבות משתמש לתקן וללוקח זמן. לצורך ההמחשה, דוגמאות של צלחות עמוסות כראוי וכהלכה מוצגות באיור 6. איור 1. תרשים הזרימה המסכם את השלבים הכרוכים בייצור, הקצירה וcryo-הקירור של גבישי חלבון קרום טווה שבגר. צעדים מוקפים הקו האדום המקווקו הם המוקד של מאמר זה יופיטר. רובוטים שמשו לוותר פתרוני mesophase ופזיזים בצעדים 29-32. מ3 קוד. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. איור 2. צלחת טעונה בהמלוא ונחתם 96-גם זכוכית כריך התגבשות. כל באר מכיל פתרון מזרז 1 μl שלב מעוקב 50 nl ו. למען בהירות, השלב מעוקב כבר מוכתם בסודאן אדומה והפתרון המזרז כולל כחול מתילן. מעיון 5. _upload/4000/4000fig3.jpg "alt =" איור 3 "/> איור 3. בטווה רובוט (1 רובוט). הרובוט יש שתי זרועות. זרוע 1 dispenses mesophase lipidic החלבון לאדן. זרוע 2 dispenses פתרונות נחפזים. במהלך מילוי, הצלחת 96-גם נשארת תקועה בעמדה על הסיפון של הרובוט שעצמו הוא נייח. שתי הזרועות לנוע כדי לספק פתרוני mesophase ופזיזים. מ3 קוד. איור 4. יתוש LCP הרובוט (רובוט 2). בניגוד לרובוט 1, סיפון LCP היתוש, שעליה יושב צלחת 96-היטב ובלוק הפתרון המזרז, נע אופקי במהלך המילוי. איור 5. Gryphon LCP הרובוט (3 רובוט). במהלךלהגדיר, מנפק השלב מעוקב lipidic נע כדי לספק חלבון mesophase עמוס לצלחת 96 היטב. הסיפון לאחר מכן מתרגם אופקי כדי למקם את הצלחת מתחת לראש קצה הפתרון המזרז. כל 96 הפתרונים נחפזים הם חלקו בו זמנית. תמונת מקורו מהיצרן (http://www.artrobbins.com/) וכותרתו. איור 6. צלחת טעונה בהמלוא ונחתם 96-גם זכוכית כריך () ובארות כראוי (ב ') ושלא כדין (C, D) מלא שימוש ברובוט טווה (1 רובוט). תווית ברקוד על הצלחת במשמשת כדי לעקוב אחר הצלחת בצלחת מכשיר החממה / הדמיה. בלוחות BD פתרון, מזרז וmesophase מסומנים P ו-M בהתאמה. 'ביצה המטוגנת במחבת' הצפויהההופעה הטובה בB היא אופיינית לנטען כראוי ואטום היטב. ב-C, פזיז כבר חלק לתוך באר שלא כהלכה בעמדה מחוץ למרכז ובא במגע עם spacer. ב-C, שהוא יופיע מדי כי היקף mesophase הוא פחות ממה שצריך להיות. דוגמה לטעינה שלמה עם פתרון מזרז מוצגת בד לקנה מידה, הקוטר של כל הבארות הוא 6 מ"מ.