使用机器人在油脂中间相高通量膜蛋白的结晶

1。准备的结晶板设置机器人做结晶试验开始与制备的基板的玻璃夹心结晶板（ 图2），在参考文献2中详细描述。底板必须首先被硅烷化双棍的多孔隔板，创建的井，必须施加到板。根据材料逐项列出需要的材料和用品。 将板在纸巾上，适用几滴硅烷化溶液，均匀的板面用薄纸分发。 板浸在烧杯中的水，去除多余的硅烷化解决方案。 板的烧杯，将其放置在干燥的纸巾，硅烷化的一面，而其暴露的表面干燥用纸巾轻轻擦拭。 剥离保护盖的穿孔，双棍间隔和应用的隔离物，粘性侧下降，干燥，硅烷化的玻璃板表面。成为确保间隔件的底板上正确的位置，与上部左手角落和两个相邻的两边的间隔件和板，重合。 使用的辊或BRAYER平坦的间隔件的底板上，以建立它们之间的紧密密封。 预组装板市售（HR3-151，汉普顿研究MD11-55-100;，分子尺寸和LCP96T-UVP70U Swissci）。出于成本的原因，我们更愿意把我们自己的组装板后，上述协议。 （2） 在细观机器人1 观机器人被证明在这个视频文章中的第一个，是一个目前正在使用的MS＆FB组（ 图3）。细节的机器人，可根据材料和参考第5。的材料和成套设备NT需要使用的机器人是根据材料逐项建立的结晶试验。 将机器人的甲板上的第1节中制备与间隔件的底板。它有自己的平台，标志着底板对齐的目的，具有良好的位置。板应标记，以资识别。 固定96孔沉淀剂的块在其自己的平台的甲板上的机器人旁边的结晶板。 小心打开块脱落的塑料密封帽。 打开加湿器和指示在甲板上的机器人的底板和跨潮湿的空气流的。已被证明的加湿以减少沉淀剂溶液的蒸发，并增强跨越的结晶板5的重现性。它可以被打开之前设置预加湿的区域环境相对湿度低时，或以其他方式，就在中间相开始分配。 初始化机器人按照制造商的说明。仪器的具体说明不会在任何细节，因为确切的程序会随时间而改变。从本质上讲，期间发生初始化的是，在机器人上的分装臂的中间相，在三个正交方向X，Y和Z设置有基准位置将蛋白质的载货中间相微量注射器，点胶针，手臂的机器人（ 图3）。如何准备的中间相，以及如何将其加载到注射器中的全部细节已在参考文献3,7-10。 从隔板上的结晶底板拆下上部的保护盖，和在平板上的孔对齐，基准点上的底板平台。注意，对于该视频的目的，保护盖留在原地，以帮助在查看器的取向步骤期间。 对齐分配希瑞恩的针尖e的底部以及在左手角落的结晶板（孔A1）的最上面。这是通过眼调节的高度或Z-坐标的分装臂一边看如何接近的针尖来的阱的底部。可以判断的平台上，而有一点点调节分配的手臂的高度，从一侧向另一侧移动板的尖端刚刚接触到井底。 输入到计算机中的分装臂的前端接触的板的Z-坐标。配药被编程，以在从该基准的Z位置对应的基板的表面的80微米与针尖。 由眼睛的针尖在中心孔A1的位置。储存在控制计算机的参考X，Y坐标的分配臂尖为中心。此坐标被用来定义盘上剩余的井的中心。 镨输入法使用适当的命令机器人计算机上，以确保新鲜的中间相填充的注射器的分配针和第一和随后的井接收其全部的中间相。挤压中间相的针尖，用纸巾擦去。 启动运行机器人（X-AP）计划发起了一轮的沉淀分配的机器人臂的提示进行清洗，并准备吸解决方案的沉淀块的冲洗步骤。 激活分配函数在机器人上设置在运动顺序装载与载货蛋白的中间相（通常是50 nl）的第一，八口井的列，在一个时间，然后通过沉淀剂溶液（通常为800 nl）的水井。加载列之间，中间相送出臂返回到停车位置的针头末端被放置在一个湿的海绵干燥，以防止中间相的尖端处。配药中间相和沉淀剂的方法，重复横跨板11次，直到板填充。与中间相和沉淀剂的装载的96孔板中以5分钟来完成。 只要填充板和机器人手臂已经回到公园的位置，取出盘子从甲板上的机器人，并把它放在一个平坦的固体表面。 随即，密封板的盖玻璃，以及组合物的随时间的变化最小化。重要的是要确保完全覆盖所有96个孔，该玻璃盖对准方形与底板和盖玻璃，没有延伸超出底板的足迹。甲的辊或BRAYER用于建立紧密和均匀的密封件之间的盖玻璃和隔板。 检查板，可以肯定的，因为它应该去设置。什么人找的是一个“炸蛋上的泛在每口井的外观。炒鸡蛋的蛋黄相对应的中间相。白色的蛋是沉淀的解决方案和平底锅的边缘的周长是结晶良好。在理想的情况下，三是同心的。 板放置在用于晶体生长的温度 – 控制的存储区域。 如果没有更多的板块设置，删除的沉淀块从甲板的机器人，封紧袋口，并把它放回存储。 包含中间相从分配的机器人手臂上取下注射器，拆除，部分，包括针头和套圈，仔细洗，甲醇和干，准备以备下次使用。 3。 在细观机器人2中。蚊子LCP 蚊子LCP的机器人（ 图4）采用类似的中间相分配器机器人1所使用的。相反的机器人，它通过分发沉淀的一次性吸头。使用编程软件来设置仪器工作与特定的的结晶板和precipit蚂蚁块，在一个指定的序列，以及免除用户定义的卷的中间相和沉淀剂。这样的细节由生产商所提供的，并在这里将不进行描述。 准备一个Hamilton注射器，完全用针和充满蛋白质载货中间相，如上述那样根据机器人1和JOVE文章1712 1。 夹紧位置上的分装臂的机器人的注射器。 使用安装在甲板激光传感器建立分配注射器的针上的X和Y坐标。这是一个重要的步骤，以确保准确地被分配的中间相上的板在各孔的中心。 随着触摸控制面板上的一个按钮，总理的注射器的针排出中间相。取出挤压的中间相从针尖与组织中准备用于使用机器人井加载。 前放置在甲板上的机器人的湿润的结晶板连接平台，用几滴的水，以帮助保持板在毛细作用的表面。 从间隔的玻璃底板上取下保护盖，并将其放置在其平台上牢固，确保良好的附着力。在平台上使用的三个基准点对准3角井，从而确保适当的定位孔的上盘相对于分送针尖。该仪器现在命令输入分配周期。 第二个吸步骤中间相被分配到一个小玻璃盘前加载井用新鲜的中间相周期的开始。的机器人第一中间相负载时的盘上的8孔一列垂直的，然后使用一次性吸头的顶部分配沉淀剂溶液的中间相丸剂。沿板的长度，重复该过程11次，直到所有的井填充。整个过程大约需要5分钟才能完成。 清除从机器人平台填充板和密封用的盖玻璃，如上所述，根据机器人1。 板放置，适当标记的，在晶体生长的温度控制环境。 4。 在细观机器人3。狮鹫LCP 狮鹫LCP的机器人（ 图5）采用上面所描述的机器人1和2类似的中间相分配系统。什么区别于其他两个是同时，所有96个沉淀的解决方案中分配。 准备载货的蛋白质-中间相，将其加载到分注注射器中，如上所述，根据机器人1和2，并在JOVE文章1712 1。 夹紧位置上的分装臂的机器人的注射器。 沉淀剂溶液块和结晶板放置在甲板上的机器人。 装入96尖HEAD与沉淀的解决方案。用户定义的延迟时间，以方便吸粘性沉淀。 命令仪器进入点胶周期。周期开始时，中间相顺序被分配到一个过程，需要大约1分钟完成的96口井在。然后，该96尖头一次分配所有96沉淀剂的解决方案的顶部的中间相在结晶井的丸药。整个板块在加载过程结束后2分钟。 从机器人平台卸下填充板和密封用的盖玻璃，如上所述，根据机器人1。 板放置，适当标记的，在晶体生长的温度控制环境。 5。代表性的成果此视频文章的目的是演示如何设置自动结晶实验，带有粘性的，膜蛋白载货的中间相的玻璃sandwic小时96孔结晶板。强调的是自动化，通过使用专门的机器人，需要最少的人工干预。可重复性和精确性，大量的中间相和沉淀分配，而在井的位置，当机器人。这些都是重要的从点有效的筛选条件，支持crystallogenesis视图。他们也分析管道中的下一步骤是评估经常做的晶体生长与成像设备的关键。下降或静脉推注的位置是关键的成像过程，，不规则放置不当的丸井通常需要用户干预以纠正，并需要一定的时间。的正确和不正确的加载板的实施例用于说明的目的， 如图6中所示。 图1的流程图总结了在生产，收获和低温冷观种植的膜蛋白晶体所涉及的步骤。红色虚线包围的步骤是此朱庇特的文章关注的焦点。机器人用，步骤29-32，免除中间相和沉淀的解决方案。从参考文献3。 点击此处查看大图 。 图2，一种完全加载并密封的96孔玻璃夹心结晶板。在各孔中含有50 NL立方相和1μl的沉淀剂溶液。为了清楚起见，立方相已与苏丹红染色和沉淀剂溶液包括亚甲基蓝。从参考文献5。 _upload/4000/4000fig3.jpg“ALT =”图3“/> 图3： 在，细观机器人（机器人）。该机器人有两个武器。臂1分注蛋白质充满油脂的中间相。臂分配沉淀的解决方案。在填充过程中，在96孔板中保持固定在甲板上的机器人本身是固定的位置。两只手臂移动，提供中间相和沉淀的解决方案。从参考文献3。 图4。蚊子：LCP机器人（机器人2）。在机器人1，蚊子的LCP的甲板，赖以坐的96孔板中和沉淀剂溶液块相比，在填充过程中水平移动。 图5。：狮鹫，LCP机器人（机器人3）。在一个成立，脂质立方相分配器转移到96孔板中，以提供蛋白质的载货的中间相。甲板上，​​然后翻译水平的沉淀剂溶液尖头定位下盘。同时配发了96沉淀的解决方案。的图片来自制造商（ http://www.artrobbins.com/ ）和标记。 图6。完全装载和密封的96孔玻璃夹层板（A）和井正常（B）和不正确（C，D）使用在，细观机器人（机器人）的填充。板在条形码标签上A用于跟踪板在板孵化器/成像设备。面板的BD中，沉淀剂溶液和中间相的标记P和M分别。在锅上的预期的'炒鸡蛋以及在B的外观是一个适当的加载和密封良好的特征。在C中，沉淀剂，已被分配入井不当在偏离中心的位置，并在与隔离物接触来。在C语言中，它会显得过于中间相的体积比它应该是。 D.对于规模与沉淀剂溶液的不完全加载的一个例子中所示，所有的孔的直径为6毫米。