Este estudo descreve o desenvolvimento de um<em> In vitro</em> Técnica de electroporação que permite a manipulação da expressão do gene no lábio inferior rômbico de embriões midgestation.
O lábio rômbico é um neuroepitélio embrionário localizado no cérebro posterior na junção entre o tubo neural eo roofplate do quarto ventrículo (revisto em 1). O lábio rômbico pode ser subdividido no lábio superior rômbica (URL), que engloba rhombomere 1 (R1) e gera os neurónios do cerebelo eo lábio inferior rômbica (MID), que dá origem a diversas linhagens de tronco cerebral neuronais 2-4. Derivados LRL incluem os neurónios auditivos dos núcleos coclear e aqueles dos núcleos precerebellar que estão envolvidos na regulação do motor e do equilíbrio de controlo 5-8. Neurogênese a partir do LRL ocorre ao longo de uma grande janela temporal que engloba dias embrionários (E) 9,5-16,5 5, 9. Diferentes linhagens neuronais emergir do LRL como células pós-mitóticas (ou nascem) durante diferentes dias de desenvolvimento durante esta janela neurogênica.
Electroporação de construções de expressão de genes pode ser usado paramanipular a expressão do gene em células progenitoras LRL e potencialmente pode mudar o destino dos neurônios produzidos a partir desta região 10-12. Alterando a expressão gênica de células progenitoras LRL no rato através de eletroporação in utero tem sido muito bem sucedida para a manipulação de linhagens nascidos no dia embrionário E12.5 ou mais tarde, 10, 12-14. Em electroporações útero antes E12.5 não tiveram sucesso devido principalmente à letalidade associada a punção da roofplate quarto ventrículo, um passo necessário na entrega de DNA exógeno que é electroporados para o MID. No entanto, muitos LRL linhagens derivadas surgem a partir do LRL mais cedo do que E12.5 9. Estas linhagens anteriormente nascidos incluem os neurónios que compõem a reticular lateral, cuneate externo, e os núcleos olivar inferior do sistema de precerebellar que funcionam de modo a ligar as entradas a partir da medula espinal e do córtex para o cerebelo 5. A fim de manipular expressão na LRLde embriões com menos de E12.5, desenvolvemos um sistema で vitro em que os embriões são colocados em cultura na sequência de electroporação.
Este estudo apresenta um método eficiente e eficaz para manipular a expressão de genes dos progenitores LRL em E11.5. Embriões electroporado com a proteína verde fluorescente (GFP) accionada a partir do promotor CAG amplamente activa reprodutivelmente expressa GFP após 24 horas de cultura. Um aspecto crítico da presente ensaio é que a expressão do gene só podem ser alterados por causa da expressão do gene exógeno e não por causa de efeitos secundários que resultam da electroporação e técnicas de cultura. Foi determinado que os padrões de expressão de genes endógenos permanecer intacta em embriões eletroporados e culta. Este ensaio pode ser utilizado para alterar o destino das células que emergem do LRL de embriões com menos de E12.5 através da introdução de plasmídeos para a superexpressão ou derrubar (através RNAi) de diferentes pró-neurais fatores de transcrição.
A técnica で vitro electroporação apresentado neste estudo é uma nova metodologia que pode ser utilizada de forma eficiente para manipular a expressão do gene em embriões de menos de 12 dias de gestação. Colocação dos embriões em cultura permite a expressão do gene introduzido e contorna a letalidade observada quando embriões eletroporados for permitido permanecer in vivo. Esta técnica permite a manipulação da expressão gênica em células progenitoras embrionárias que anteri…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Jane Johnson para o Math1, Ngn1 e anticorpos Ptf1a e Connie Cepko para o pCAG :: GFP plasmídeo. Este trabalho foi financiado pelo NIH R15 1R15HD059922-01.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Cryostat | Leica | CM-1850 | |
Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |