تقييم المواد الحيوية لتكبير المثانة باستخدام تحليلات Cystometric في نماذج القوارض مختلفة
概要
وصفت مراحل العمليات الجراحية في زيادة المثانة باستخدام 3-D السقالات في نماذج الفئران والجرذان. لاختبار فعالية من تكوينات مادة بيولوجية لاستخدامها في عمليات تكبير المثانة، ويتم تقديم تقنيات لقياس المثانة كلا مستيقظا وتخدير.
Abstract
Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.
Protocol
Discussion
التقييمات Cystometric من تكوينات مادة بيولوجية بعد زرع المثانة وزيادة في النماذج الحيوانية الصغيرة يمثل خطوة هامة في تحديد التحقق من صحة أفضل الخصائص الهيكلية والميكانيكية والتصاميم مصفوفة لاستخدامها في الحالات السريرية. في هذه الدراسة، فإننا وصف الطرق الجراحية لإجراء عملية تكبير المثانة لدى الفئران والجرذان، وكذلك تقنيات cystometric لتحديد خصائص انسداد المثانة الأجهزة هندسيا لتقييم وظيفي. وقد استخدمت هذه التقنيات في أننا تجارب متعددة تشمل كلا من الفئران والجرذان، مع كل تجربة تتألف من القوارض + 30 بدون القضايا الهامة. مختبر أبحاثنا هي عبارة عن تكتل متنوع من العلماء والجراحين الأساسية الطبيب، والجراحين مع ما لا يقل عن 5-6 سنوات من الدراسات العليا التدريب الجراحية الجوانب الإجرائية لهذه التجارب.
بغض النظر عن نوع المستعملة مادة بيولوجية، ودي الكبرىfference بين زيادة المثانة لدى الفئران مقابل الفئران هو حجم المثانة. نظرا لصغر حجم المثانة، وتشريح، وإدراج مادة بيولوجية أكثر صعوبة من الناحية الفنية في الماوس. للمساعدة في التصور، ويمكن استخدام المجهر الجراحي. منذ حجم المثانة لدى الفئران هو أكبر، وأنها أكثر استعدادا لحالات أكثر من إجراء واحد لابد من تنفيذها على المثانة (على سبيل المثال زيادة ووضع القسطرة فغر المثانة). بالإضافة إلى ذلك، يصف بروتوكول فوق استخدام أنابيب PE-50 للجرذ 13، ومع ذلك، القسطرة حجم أكبر، وتصل إلى PE-100 المستخدمة قد تم، وخاصة بالنسبة للدراسات طويلة الأجل 14. في الفئران، ويمكن الاستفادة من عيار أصغر مثل أنابيب PE-10 15،16، ولكن ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن أنابيب مرنة أصغر حجما وأكثر قد لا نقل تغيرات الضغط على محول بدقة. كذلك، فإن طريقة بديلة لتأمين القسطرة على ظهر (الخطوة 8 * أعلاه) ويتم ذلك في ميلم بسبب حجمها أصغر الجسم وإبرة طرف كليل وقبعة الرابع هي مرهق للغاية. وعيب هذا هو الحاجة للتخدير لاستخراج نهاية القسطرة في كيس تحت الجلد قبل قياس المثانة.
وقد أظهرت الدراسات أن في الأيام الأولى الأولي (0-4 أيام) بعد موضع القسطرة، قياس المثانة وكشف الضغوط العالية وفرط نشاط المثانة مع وحدات التخزين يفرغ منخفض. ظهرت هذه النتائج لتحقيق الاستقرار في جميع أنحاء السادس إلى اليوم السابع 14،17، وبالتالي، وربما كان توقيت مثالي لتقييم cystometric. ومع ذلك، فإن معظم التقارير في الأدب أداء قياس المثانة في غضون أول 3 أيام من قسطرة 18، والحسابات هذا لتباين واسع في المعلمات أعلاه بالنسبة للوقت. ترك قسطرة فوق العانة لمدة أطول من 3 أيام تحمل معها حالة مرضية مختلفة مثل خطر من الحجارة، والخلع، والعدوى، بيلة دموية وانسداد القسطرة مع الحطام.
<وقد وصفت ف الطبقة = "jove_content"> معدلات ضخ مختلفة خلال قياس المثانة من 1-3mL/hr بالنسبة للفئران و15،16 10-11mL/hr للفئران 13،19،20. يمكن أن معدلات ضخ Supraphysiologic يسبب ضغوطا مرتفعة زورا 14. نحن نستخدم معدل ضخ 12.5 ميكرولتر / دقيقة (0.75 مل / ساعة) ويمكن أيضا للفئران و 100 ميكروليتر / دقيقة (6 مل / ساعة) بالنسبة للفئران في الإعداد لدينا، ولكن انخفاض معدلات استخدامها. وينبغي أن درجة حرارة المياه المالحة الفسيولوجية تكون على الأقل درجة حرارة الغرفة، على الرغم من دافئ (37 درجة) المالحة هو أكثر المثلى لتجنب فرط نشاط المثانة وأثار مع غرس حل الباردة. في قياس المثانة مستيقظا، من الأهمية بمكان للسماح لتحقيق الاستقرار في نمط يفرغ كما الحيوان تعديلها ليصبح القفص، والتي في تجربتنا يتطلب فترة من 10-20 دقيقة ~. بعد هذا، يمكن تسجيل الدورات العادية للتبول 45-120 دقيقة أو في الحد الأدنى دورات يفرغ 3-4. ينبغي مراعاة هذا الحيوان في الوقت الحقيقي منذ الحيوان موفن بحريةويمكن ز والمضاعفات مثل التواء أو مجعد القسطرة تغيير تحليل cystometric. الحد من الضوضاء البيئية خلال قياس المثانة هو المطلوب لتقليل حركة الحيوانات والأعمال الفنية اللاحقة. قياس المثانة فاقد الوعي لا يملك المشاكل المصاحبة مثل قياس المثانة مستيقظا، ولكن ثبت التخدير متعددة لمنع تقلصات المثانة عفوية. هذا تثبيط يقابل مباشرة إلى المدة المتوقعة لعمل أدوية التخدير، أي عندما تخف حدة تأثير مخدر، تقلصات عفوية استئناف 14. وعلاوة على ذلك، كانت الضغوط تقاس عندما فاضت المثانة، وزيادة إحصائيا في الفئران تخدير، وكلاهما على قيد الحياة وبعد الوفاة، مما يشير إلى تأثير على خصائص الإذعان السلبي للجدار المثانة. ويظهر هذا التأثير مع 21 بنتوباربيتال، الكيتامين، و. كلورالوز IM / IP، بالإضافة إلى هالوثان المستنشق وداخل القراب nesacaine 14 وأجرت دراسة واسعة من مختلف confir التخديرم هذه النتيجة مع قمع منعكس التبول لمواد التخدير على حد سواء الاستنشاق (isoflurane وmethoxyflurane)، والباربيتورات (بنتوباربيتال وthiobutabarbital) تحت التخدير مستويات معتدلة 17. وقد لوحظ هذا التأثير مع ضوء المستويات حتى المسكنات أو التخدير مع أدوية مثل الفنتانيل-دروبيريدول والكيتامين الديازيبام، وكما في الدراسة السابقة، حيث أن تأثير التخدير هدأت، وكذلك فعل تثبيط 17. لهذا الإجراء، يمكن استخدام الحقن داخل الصفاق يوريتان منذ تم التدليل على أن يتم الاحتفاظ تبول لا ارادي في الوقت الذي تسمح أيضا للتخدير كاف 17،22. وعلاوة على ذلك، يلاحظ وجود أي تأثير فيما يتعلق الضغوط التبول 23. يوصف وضع القسطرة فوق العانة لقياس المثانة هنا، لأنه تبين القسطرة داخل الاحليل لديها أعلى منحنيات ضغط المثانة وانخفاض معدلات تدفق تتفق مع النسبية المثانة انسداد مخرج 24.وعلاوة على ذلك، قسطرة داخل الاحليل هو ممكن فقط في الحيوانات تخدير، وحتى ذلك الحين، قسطرة يمكن أن يكون صعبا، وخصوصا في القوارض والفئران الذكور.في الختام، واختيار النموذج الذي ترغب في استخدامه لتكبير المثانة و / أو تحليل cystometric يعتمد على أهداف دراسة محددة. من الناحية التقنية في نموذج الفئران يحمل بوضوح ميزة للأسباب التي ذكرناها آنفا. ومع ذلك، يمكن استخدام نموذج الفأر في دراسات تقييم أدوار محددة المنتجات النهائية الجينات المرمزة في أمراض المسالك البولية، وذلك بسبب قابليتها للتلاعب الجيني. هذا ليس ممكنا عادة في الفئران.
قياس المثانة مستيقظا معظم بدقة يحاكي الحالة الطبيعية الفسيولوجية في هذه الحيوانات التي تخضع لدورات التبول بهم، وغير ذلك، من المرجح أن يعطي عزم أكثر موثوقية الفسيولوجية في وظيفة المثانة. وعلاوة على ذلك، فإن المتغير التباس من الآثار المباشرة لليتم تجنب nesthetics على وظيفة المثانة.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتم تمويل هذه الدراسات، في جزء منه، من قبل مستشفى الأطفال في بوسطن صندوق جراحة المسالك البولية للإيرادات الأوقاف والمعاهد الوطنية للصحة منح NIBIB P41-EB002520 (كابلان)؛ NIDDK T32-DK60442 (فريمان)؛ NIDDK 1K99-DK083616 (Mauney). نحن نعترف الدكتور بيتر Zvara من جامعة فيرمونت للحصول على المساعدة في إنشاء تقنية لوضع أنبوب فغر المثانة وقياس المثانة.
Materials
| Materials: | Description/Use: | |||
| Shaving shears | Preparation of rat/mouse for surgery | |||
| Sterile drapes, betadine, 70% ethanol, sterile gauze | Preparation of sterile surgical field | |||
| Instruments: | ||||
| Scalpel blade | Skin incision | |||
| forceps with teeth | Manipulating skin | |||
| Fine forceps | Atraumatic (no teeth), no serrations or with fine serrations to manipulate | |||
| Small needle driver | Sharp tissue dissection | |||
| Metzenbaum scissors | Bldder incision | |||
| Tenotomy scissors | For retraction sutures and to develop subcutaneous tunnel (cystostomy catheter) | |||
| Small curved clamps | Subcutaneous tunnel (cystostomy catheter) | |||
| Sutures: | ||||
| 6-0 polypropylene sutures | Bladder stay sutures and pursestring suture | |||
| 7-0 polyglactin suture | Anastomosis of scaffold to bladder | |||
| 4-0 polyglactin suture | Closure of muscle/skin | |||
| 3-0 or 4-0 Silk suture | Securing catheter tip to skin | |||
| Needles and syringes: | ||||
| 18 Gauge needle | Piercing the bladder for cystostomy catheter | |||
| 25 and 30 Gauge needles | Testing bladder for leakage | |||
| 1 mL saline filled syringe | ||||
| 22 Gauge blunt tip needle | ||||
| Cystostomy catheter: | ||||
| PE-50 tubing | ||||
| Lighter | Flaring PE-50 tubing | |||
| Small curved clamp | Developing subcutaneous tunnel | |||
| Cystometry: | ||||
| MLT844 ADInstruments data capture and LabChart software | Pressure data acquisition | |||
| Harvard 22 syringe pump (Harvard Apparatus, Holliston, MA) | Fluid infusion pump | |||
| Anesthetics (Unconscious cystometry): | ||||
| Isoflurane | Induction/maintenance of general anesthesia | |||
| Urethane | Unconconscious cystometry | |||
| Bupivicaine or equivalent | Local anesthesia | |||
| Meloxicam | Post-operative analgesia | |||
| Buprenorphine | Post-operative analgesia | |||
参考文献
- Atala, A. Tissue engineering for bladder substitution. World. J. Urol. 18, 364-370 (2000).
- Roehrborn, C. G. Male lower urinary tract symptoms (LUTS) and benign prostatic hyperplasia (BPH). Med. Clin. North Am. 95, 87-100 (2011).
- Niknejad, K. G., Atala, A. Bladder augmentation techniques in women. Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. 11, 156-169 (2000).
- Hensle, T. W., Gilbert, S. M. A review of metabolic consequences and long-term complications of enterocystoplasty in children. Curr. Urol. Rep. 8, 157-162 (2007).
- Somani, B. K. Bowel dysfunction after transposition of intestinal segments into the urinary tract: 8-year prospective cohort study. J. Urol. 177, 1793-1798 (2007).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, 1241-1246 (2006).
- Sharma, A. K. A nonhuman primate model for urinary bladder regeneration using autologous sources of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 29, 241-250 (2011).
- Chung, S. Y. Bladder reconstitution with bone marrow derived stem cells seeded on small intestinal submucosa improves morphological and molecular composition. J. Urol. 174, 353-359 (2005).
- Ashley, R. A. Regional variations in small intestinal submucosa evoke differences in inflammation with subsequent impact on tissue regeneration in the rat bladder augmentation model. BJU Int. 105, 1462-1468 (2010).
- Zhang, Y., Frimberger, D., Cheng, E. Y., Lin, H. K., Kropp, B. P. Challenges in a larger bladder replacement with cell-seeded and unseeded small intestinal submucosa grafts in a subtotal cystectomy model. BJU Int. 98, 1100-1105 (2006).
- Gomez, P. The effect of manipulation of silk scaffold fabrication parameters on matrix performance in a murine model of bladder augmentation. Biomaterials. 32, 7562-7570 (2011).
- Mauney, J. R. Evaluation of gel spun silk-based biomaterials in a murine model of bladder augmentation. Biomaterials. 32, 808-818 (2011).
- Persson, K. Spinal and peripheral mechanisms contributing to hyperactive voiding in spontaneously hypertensive rats. Am. J. Physiol. 275, 1366-1373 (1998).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am. J. Physiol. 251, 1177-1185 (1986).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J. Urol. 164, 1385-1389 (2000).
- Soler, R., Fullhase, C., Lu, B., Bishop, C. E., Andersson, K. E. Bladder dysfunction in a new mutant mouse model with increased superoxide–lack of nitric oxide. J. Urol. 183, 780-785 (2010).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol. Urodyn. 19, 87-99 (2000).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
- Soler, R., Fullhase, C., Santos, C., Andersson, K. E. Development of bladder dysfunction in a rat model of dopaminergic brain lesion. Neurourol Urodyn. 30, 188-193 (2011).
- Streng, T., Santti, R., Andersson, K. E., Talo, A. The role of the rhabdosphincter in female rat voiding. BJU Int. 94, 138-142 (2004).
- Malmgren, A. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J. Urol. 137, 1291-1294 (1987).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol. Urodyn. 29, 1344-1349 (2010).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).
- Smith, P. P., Hurtado, E., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Comparison of cystometric methods in female rats. Neurourol. Urodyn. 27, 324-329 (2008).
