단백질 접기 유학을위한 Microfluidic 믹서
概要
이 작품에서 우리는 ~ 8 μs 두 솔루션을 혼합 수 microfluidic 믹서의 제조 및 사용을 설명합니다. 또한 자외선 형광 및 형광 공명 에너지 전달을 (무서워)를 사용 spectroscopic 감지 이러한 믹서의 사용을 보여줍니다.
Abstract
그 기본 형태로 단백질 폴드는 생물학과 인간의 건강 아직은 저조한 이해 깊은 관련성이있는하는 과정입니다. 이것에 대한 한 가지 이유는 폴딩이 단백질의 1에 따라 나노 초에서 초 이상으로, timescales 다양한 통해 이루어지는 것입니다. 기존 정지 – 흐름 믹서는 접는 속도론의 측정은 약 1 MS에서 시작 허용했습니다. 우리는 최근 ~ 8 μs 2 denaturant는 ~ 100 배 dilutes microfluidic 믹서를 개발했습니다. 정지 – 흐름 믹서와 달리,이 믹서는 난기류가 발생하지 않습니다하는 층류 정권에서 운영하고 있습니다. 난류의 부재 3-4 실험하는 훌륭한 합의와 믹서 내의 모든 흐름의 정확한 숫자 시뮬레이션이 가능합니다.
층류는 ≤ 100을 다시 레이놀즈 번호에 대해 이루어진다. 수성 솔루션의 경우,이 마이크론 스케일의 형상을 필요로합니다. 우리는 실리콘 또는 융합된 sili로, 하드 기판을 사용CA, (그림 1 참조) 채널 5-10 μm의 넓은 및 10 μm의 깊이 있도록. 작은 크기는, 혼합 지역으로 입구 크기 1 μm의 순서에 있습니다. 이 칩은 광학 액세스 얇은 유리 또는 융합된 실리카 coverslip으로 날인합니다. 대표적인 총 선형 유속은 ~ 1 M / s의 매우 저조한 재 ~ 10이지만 단백질 소비가 전용입니다 ~ 0.5 NL / s 또는 1.8 μL / 시간.에게 단백질 농도는 검출 방법에 따라 다릅니다 : 트립토판 형광의 경우 전형적인 농도는 100 μm의 (1 TRP / 단백질의 경우)이며 전형적인 농도가 ~ 100 nm의입니다 안달을 위해.
접는 과정은 6 M에서 0.06 M 구아니딘 염산염으로 denaturant의 급속한 희석에 의해 시작됩니다. 높은 denaturant의 단백질은 중앙 채널 아래로 흐르고 denaturant합니다 (그림 2 참조) ~ 100 배 빠르게 이동하지 않고 버퍼에 의해 혼합 영역에서 양쪽에 만난됩니다. 이 기하학은 좁은으로 단백질 흐름의 급격한 수축을 초래제트 ~ 100 nm의 폭. 무거운 단백질 분자의 확산이 많이 느린 한 MS의 diffusing 미만 1 μm의 상태에서 빛을 denaturant 분자의 보급은 매우 빠른 속도이다. 단백질 주위 denaturant의 효과적인 농도를 감소 denaturant과 단백질 스트림에서 denaturant의 급속한 희석에있는 단백질 결과의 지속적인 확산의 차이,. 단백질 제트는 스캐닝 공촛점 현미경 5를 사용하여 관찰할 수있다 개고 동안 단백질의 관찰 채널 및 형광 아래로 일정한 속도로 흐른다.
Protocol
Discussion
그것이 긴 biomolecules의 분자 프로세스 picoseconds에서 초에 이르기까지 다양한 시간 단위를 통해 발생하는 인식 되었기 때문에 급속한 믹싱은 수년 동안 단백질 폴딩의 필드에 대한 개발 목표왔다. 기존 정지 – 흐름 믹서는 주로 난류에 의해 제한되는 1-5 MS의 죽은 시간이 있습니다. 30-300 μs의 혼합 시간과 지속적인 난류 유동 믹서는 그룹의 소수에 의해 지난 15 년간 개발된지만 일반적으로 다음과 믹싱 시간을 달성하기 위해 높은 유량을 필요로하므로 샘플 6-8를 많이 사용되었습니다.
이 프로토콜은 층류 정권에 신속하게 희석를 달성하기위한 microfluidic 혼합 칩의 사용을 설명합니다. 가이 정권 내에서 작동으로 여러 장점이 있지만 기본 하나 하나가 혼합 반응을 수정할 수있는 높은 정밀도와 전체 믹싱 과정을 시뮬레이션할 수있는 능력입니다. 간단한 geom 다른 그룹에 의해 개발된 T-믹서etries는 주로 채널 9-10의 크기에 의해 제한되었다 100-200 μs의 혼합 시대를 증명하고있다. 10 μm의 나이트로 채널의 크기를 축소함으로써 ~ 10 μs 11 ~ 혼합 시간 단축. 야오와 Bakajin은 기하학의 작은 변화가 혼합 시간 4의 상당한 개선으로 이어질 수 있다고했다. 그러나 그 작품은 혼합의 가속도도뿐만 아니라 느린 단계로 이어질 수있다 보여주었다. 이 작품은 12-13에 사용되는 디자인 denaturant 농도의 느린 지수 붕괴를 최소화하고 또한 DRIE 에칭의 기능이 더욱 재현할 수 있도록 참조 4의 두 최고의 디자인 사이의 타협이다.
혼합 시간의 정의를 통해 믹싱 ultrarapid의 분야에서 어떤 논쟁이 일어났습니다. 그것은 "혼합 시간"과 "죽은 시간"의 차이를 인식하는 것이 중요합니다. 죽은 시간 동안 measuremen 시간을 난류 믹서에서 정의됩니다T는 만들 수 없으며 실제로는 실제 혼합 시간보다 훨씬 더 오래있을 수 있습니다. 그것은 일반적으로 다양한 농도에서 의사 최초 주문 bimolecular 반응 (예 : N bromosuccinate 의한 트립토판 형광 담금질 등)의 여러 측정함으로써 결정됩니다. 관찰된 지수 붕괴는 t = 0의 것으로 추정 하나의 값으로 수렴하기 위해 장착하고 그 시점과 첫 번째 측정 시점 사이의 시간은 죽은 시간이다됩니다. 도 죽은 시간에만 믹싱 시간이 없다 있도록 판상 흐름 믹서의 경우 성능은 믹싱 과정에서 만들 수 있습니다. 혼합 시간은 단순히 충분한 균일에 도달할 때까지 서로 다른 두 솔루션을 결합하는 시간입니다. 우리는 이전에 10분의 90 시간, unmixed 가치의 10 % ~ 90 % 감소한하기 denaturant의 농도에 대한 시간이 될 혼합 시간을 정의했습니다. 그러나, 혼합 곡선의 형태는 작은 지수 구성 요소를 갖는 부패의 꼬리와 완벽하게 대칭이 아닙니다. 또한, 단백질 폴딩이있다denaturant 농도에서 높은 비선형 의존도 그 접는가 자주 denaturant가 두 배 이상 감소되는 경우에도 개시하게 할수 있습니다. 따라서 우리는 최근 80 % denaturant 농도를 감소시키는 시간으로 혼합 시간을 정의했습니다. 물론 다른 정의는 실험의 요구에 따라 사용할 수 있습니다.
단백질 접힘 연구를 위해이 믹서의 사용은 지속적으로 놀라운 결과를 발표했다. 오랫동안 지속적인 흐름 믹서로 여러 개의 접는 단계와 초기 결과를 가지고 연구되어 시토크롬 C와 apomyoglobin의 개고 것은 ~ 100 μs timescale 10,14-15에서 발생하는 붕괴를 보여주었다. 이 믹서와의 측정합니다 (느린 단계 다음 믹서의 혼합 시간 내에, 매우 빠르고 가능성이 불특정, 붕괴합니다 (TRP 형광 스펙트럼의 변화로 측정)이 timescale에 최소한 2 단계가있을 보여준 ) 총 TRP 방출의 담금질에 의해 측정된 그 가능성 F입니다기본 구조 5 irst 형성. 우리는 또한이 단백질은 2 주 폴더에 13이라는 종래의 해석을 overturning, 단백질 L의 지하 도메인에 50 μs 과정을 관찰했습니다.
이러한 급속한 믹서의 장점은 일반적 nanosecond T-점프 악기에 의한 measureable 있었 빠른 접는 단백질의 폴딩을 알아내기 수있다는 것입니다. T-점프는 일반적으로 개고 / 단백질의 녹는 온도 근처에서 휴식을 펼쳐 따라서 전체 인구의 접는을 따르고 절대 관찰이 필요합니다. 이 믹서를 통해 우리는 TRP 총 방출 및 스펙트럼 시프트 모두와 γ-억제의 폴딩 (λ 6-86)를 방문한 적이 있으며 단백질 이전 T에 액세스할 수 없다는 강한 접는 조건 하에서 개고 아무 장애가 없다는 증거를 발견했습니다 측정에게 12 – 점프. 마지막으로 우리는, T 중 하나를 villin의 투구 HP-35 접는을 측정했습니다그는 빠른 폴더는 아직 측정 및 혼합 후 측정 접는 비율이 동일한 조건 16 세 미만 T-점프로 측정하는 것보다 ~ 5 배 느립니다 것으로 나타났습니다. 이것은 접는 속도론이 분야의 주요 가정을 overturning, 시작 조건에 따라하는 것이 좋습니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 FIBR (NSF EF-0623664)와 IDBR (NSF DBI-0754570)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 부분적으로 협동 협정 PHY 0,120,999하에 캘리포니아 대학, 데이비스에 의해 관리 Biophotonics, NSF 과학 기술 센터를위한 센터에서 관리 국립 과학 재단 FIBR 그랜트 0,623,664로부터 자금 지원에 의해 지원되었다. 리사 Lapidus, 박사의 연구 버로우즈 웰컴 기금에서 과학 인터페이스에서 경력 수상에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thor Labs | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor Technology | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
参考文献
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