Video-oculografie in Muizen

1. Voorbereiding De volgende experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Duch Ethische Commissie voor Dierproeven. Voorbereiden muizen voor video-oculografie. Voor het meten oogbewegingen van een muis, de kop van de muis moet worden geïmmobiliseerd. Daarom is een voetstuk constructie op de schedel van de muis (figuur 1). Verdoof de muis door een mengsel van isofluraan (isofluran 1-1,5%; Rhodia Organique Fine Ltd, Frankrijk) en zuurstof in een gaskamer. De overmatige gas wordt weggevangen. Houd verdoving via neuskegel. Bevestig diepte van de anesthesie door middel van een teen knijpen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37 ° C met behulp van een anale thermosensor en een verwarmingselement (FHC, Bowdoinham, ME). Bescherm de ogen door ze te bedekken met een oogzalf (duratears, Alcon, België). Scheer de dorsale craniale bont, en maak het chirurgische gebied met een rotatie van struikgewas en betadine of chloorhexidine oplossing. Maak een middenlijn incisie aan de dorsale craniale oppervlak van de schedel bloot te leggen. Maak het oppervlak schoon en droog. Breng een druppel van fosforzuur (fosforzuur gel etsmiddel 37,5%; Kerr, CA) op de rug craniale oppervlak van de schedel van bregma naar lambda. Verwijder de etsmiddel na 15 seconden en maak de craniale oppervlak weer schoon met een zoutoplossing en droog. Pas op de top van deze geëtste schedel oppervlak van een druppel OptiBond prime (Kerr, CA) en de lucht drogen gedurende 30 seconden. Plaats een druppel OptiBond lijm (Kerr, CA) op de top van de OptiBond prime en genezen met licht gedurende 1 minuut (Maxima 480 zichtbaar licht uitharden eenheid; Henry Schein, USA). Bedek de lijmlaag met een dunne laag van samengestelde Charisma (Heraeus Kulzer, Duitsland). Embedden twee met elkaar verbonden noten (diameter: 3 mm) in de composiet. Cure de composiet daarna met licht. Indien nodig, aanvullende lagen van composiet en hen genezen met licht. Advertentieminister buprenorfine (0,015 mg / kg, sc) voor post-operatieve analgesie. Het dier moet weer op de been binnen ongeveer 5 minuten. Laat de muis in de kooi terug bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 dagen na de operatie. Video-oculografie setup voor muizen (figuur 2). Plaats de muis in de weerhouder en zet zijn hoofd naar de weerhouder met twee schroeven (figuur 1). De muis niet worden verdoofd deze procedure. Huisverbod tijd mag niet meer dan 1 uur / dag. Plaats de muis hoofd-lichaam restrainer op xy, die op zijn beurt is gemonteerd op de draaitafel (diameter 60 cm). De xy de muis kop worden geplaatst boven het midden van de draaitafel. De muis kan worden verplaatst op het veld, yaw en roll assen. Het hoofd van de muis wordt geplaatst in de juiste toonhoogte, yaw en roll hoek door het gelijktrekken van het oog met behulp van het visuele beeld van het oog die door de iScan system. Alternatief kan het voetstuk constructie worden op de kop van de muis in een stereotactisch frame 11. De draaitafel is aangesloten op een AC servo-gestuurde motor (Harmonic rijden AG, Nederland) en de positie van de draaitafel wordt bewaakt door een potentiometer (Bourns inc., CA) bevestigd aan de draaitafel as. Een cilindrische omliggende scherm (diameter: 63 cm, hoogte: 35 cm) met een willekeurige gestippelde patroon (elk element 2 °) heeft betrekking op de draaitafel, deze trommel is ook uitgerust met een AC servo-gestuurde motor (Harmonic rijden AG, Nederland) . De positie van de cilindrische zeef wordt gevolgd door een potentiometer (Bourns inc., CA) toegevoegd aan de as en het scherm kan worden verlicht door een halogeen (20 Watt). Zowel de omringende scherm en de draaitafel onafhankelijk aangedreven. De beweging van de draaitafel en rond het scherm wordt bestuurd door een computer die is aangesloten op een I / O interface (CED beperkt, Cambridge, Verenigd Koninkrijk). TaBLE en omliggende schermpositie audiosignaal (cut-off frequentie: 20 Hz), gedigitaliseerd door de I / O interface op deze computer. Het oog van de muis wordt verlicht door drie infrarood-stralers (600 mW, dispersie hoek: 7 °, piek golflengte: 880 nm, RS Components, Nederland). Twee infraroodstralers zijn bevestigd aan de draaitafel en de derde emitter is bevestigd aan de camera. Deze derde emitter levert een referentie cornea reflectie (CR), die wordt gebruikt tijdens de kalibratie en gedurende de oogbewegingen opnamen. Een infrarood CCD camera is uitgerust met een zoom lens (Zoom 6000, Navitar inc., NY) is bevestigd aan de draaitafel en is gericht op de muis hoofd in het midden van het draaiplateau. De camera kan worden ontgrendeld en kan worden yawed over de draaitafel as over precies 20 ° tijdens de kalibratie procedure. Het videosignaal wordt verwerkt door een oog volgsysteem (ETL-200, iScan, Burlington, MA). De iScan systeem maakt gebruik van een algoritme naar de centra van de leerling en de verwijzing CR volgen. Het systeem kan bijhouden van de leerling en referentie-CR in horizontale en verticale richting met een sample rate van 120 Hz. Referentie CR positie, leerling positie en pupilgrootte signalen worden gedigitaliseerd door de I / O-interface en worden opgeslagen in hetzelfde bestand als de tafel en de omliggende schermpositie signalen. De video leerling-tracking systeem leidt tot een vertraging van de oogbeweging signalen van ongeveer 27 ms. 2. Kalibreren en het meten van oogbewegingen Met behulp van Video Leerling-tracking Het oog volgsysteem vangt de beweging van de pupil als een translatiebeweging. De translatiebeweging van de pupil bijgehouden bevat een translatie component door axiale tussen de rotatie midden van het oog en de anatomische midden van het oog (bv middelpunt van het hoornvlies kromming) en een rotatiesnelheid component door de hoekverdraaiing van het oog. Door aftrekkenIng de referentie CR de pupil beweging / positie wordt de ongewenste component translationele geëlimineerd signaal resulterend in een translatiebeweging die alleen door de rotatie van het oog. Hoewel ze vaak zeer kleine deze aftrekking elimineert tevens de vertaling van het hoofd en de camera. De resterende geïsoleerde translatiebeweging wordt omgezet in de hoekverdraaiing van de oogbol door calibratiemethode 8,12. Deze calibratie is uitgevoerd voorafgaand aan enige oogbewegingen experiment. Pas de muis hoofdpositie de camera zodanig dat het videobeeld van de pupil ligt in het midden van het beeldscherm en dat de afbeelding van de referentie CR ligt aan de verticale middellijn van het oog voorkeur direct boven de pupil. Minimaliseren de bewegingen van de referentie CR door hoek camera rotaties, die kan worden bereikt door het midden van de cornea kromming over de camera / tabel as. </ Li> Draai de camera meermalen + / – 10 ° (bijvoorbeeld 20 graden piek) rond de verticale as van de draaitafel. Gebruik de posities van de gevolgde pupil (P) en het referentiesignaal CR opgenomen in de uiterste standen van de camera rotatie om de draaiingshoek van de pupil berekend (Rp, Rp = Δ / sin (20 °) waarin Δ = (CR -P), zie figuur 3A). Doordat de Rp is afhankelijk van de pupil, een pupilgrootte correctie moet worden uitgevoerd 12 (fig. 3B). Herhaal stap 2.2 vele malen onder verschillende belichting omstandigheden (dat wil zeggen het manipuleren van de pupilgrootte; figuur 3C) om de pupilgrootte te bepalen – Rp relatie en samen een Rp correctie curve (Figuur 3D). De Rp waarde hangt af van de verticale ooghoogte. Bij het experiment zal leiden tot verticale oogbewegingen is een correctie van de kalibratie voor verticale oog posities is zeer aan te bevelen13. Bepaal de hoekstand van het oog (E) door meting van de referentie CR positie P positie en de pupil. De referentie CR positie wordt afgetrokken van de leerling staat het genereren van een translationele gratis leerling positie. Door het meten van de pupilgrootte de Rp waarde kan worden gewonnen uit de Rp correctie curve en E kan worden berekend met behulp van de volgende formule E = arcsin {(Δ1) / Rp} (Figuur 4A, waar Δ1 = (P 2-P 1) en P1 en P2 worden gecorrigeerd door aftrekking van de referentie CR). Een grote repertoire van draaitafel en / of rondom het scherm rotaties kan nu gebruikt worden om de oculomotor te stimuleren. Om video oculografie uit te voeren in het donker, de muis oog dient te worden voorbehandeld met een mioticum geneesmiddel voor de pupil dilatatie te beperken en laat leerlingen volgen onder deze omstandigheden. In onze experimenten gebruiken we pilocarpine (4%, Laboratoria Chauvin, Frankrijk) op leerling dilatatie te beperkenhet donker. 3. Data-analyse Eye posities, tafel posities en de omliggende scherm posities zijn allemaal omgezet in hoekposities (zie figuur 4B en de formule in punt 2.4). Eye signalen worden gecorrigeerd voor de vertraging van 27 ms geïnduceerd door de beeldvorming verwerking van de leerling-volgsysteem. Hoekposities van ogen tafel omringende scherm zijn gedifferentieerd en gefiltreerd met een Butterworth laagdoorlaatfilter met een grensfrequentie van 20 Hz. Saccades worden verwijderd uit het oog snelheidssignaal met een detectiegrens van 40 ° / s. Gegevens worden verwijderd vanaf 20 ms voor tot 80 ms na het overschrijden van de detectiegrens. Tabel rond scherm en het oog snelheid signalen gemiddeld met elke cyclus in het spoor (Figuur 4C). Gemiddelde signalen worden voorzien van een passende functie. In het algemeen wordt een sinusvormig snelheid stimulatie gebruikt en de gemiddeldecycli voorzien sinus cosinus functie (Figuur 4C). Vervolgens kan de versterking worden berekend als de verhouding van het oog snelheid stimulus snelheid, terwijl de fase kan worden berekend als het verschil (in graden) tussen het oog snelheid en stimulus snelheid. 4. Representatieve resultaten Video-oculografie kan worden gebruikt om diverse vormen van oculomotorische optredens (dat wil zeggen optokinetische reflex: OKR; vestibulo-oculaire reflex: VOR, visueel verbeterde vestibulo-oculaire reflex: VVOR) te onderzoeken en motorisch leren (VOR aanpassing; OKR adaptatie). De OKR compenseert voor laagfrequente storingen met behulp van visuele feedback. De OKR kan worden geïnduceerd door het draaien van de goed verlichte omgeving scherm (Film 1). Draaien van de omringende scherm over een frequentiegebied van 0,2 -1,0 Hz met een amplitude van 1,6 ° toont hoe de optokinetische systeem een ​​doelmatige compensatiemechanisme in de lage frequenties than in de hoge frequenties (figuur 5A). De VOR compenseert hoge frequentie bewegingen van de kop met behulp van signalen van de vestibulaire organen. De VOR kan worden geïnduceerd door het draaien van het dier (dat wil zeggen draaitafel) in het donker (Film 2). De draaitafel over een frequentiegebied van 0,2 -1,0 Hz met een amplitude van 1,6 ° toont hoe de vestibulo-oculaire efficiënter is het genereren compenseren oogbewegingen in de hoge frequenties dan in de lage frequenties (figuur 5A) . Wanneer de optokinetische en vestibulo-oculaire systeem in onderling overleg handelen, kunnen de beelden worden gestabiliseerd op het netvlies over een breed scala van hoofdbewegingen. Het draaien van de draaitafel over een frequentiebereik van 0,2 -1,0 Hz met een amplitude van 1,6 °, terwijl de omliggende scherm is goed verlichte (Film 3) laat zien hoe het oog "high gain" compenserende bewegingen over het gehele frequentiebereik (Figuur 5A genereert ). Al deze versterking en phase waarden zijn kenmerkend voor muizen, hoewel mannen en vrouwen 14 en stam 15,16,17 verschillen werden gemeld. De onafhankelijke controle over de draaitafel en de omliggende scherm maakt het mogelijk om de muizen te confronteren met een mismatch tussen visuele en vestibulaire informatie. Na een lange termijn en uniforme blootstelling van verkeerde visuele en vestibulaire informatie, zal de VOR van de muis te wijzigen om te compenseren voor de gewijzigde visuele input (VOR aanpassing; Movie 4). Het draaien van de draaitafel uit fase (dat wil zeggen 180 °) met de omliggende scherm (1 Hz, 1,6 °) verhoogt de VOR winst (figuur 5B). De maximale verandering in VOR versterking, wanneer een een proces leerparadigma, vaak na 30 minuten. Figuur 1. Schematische tekening van de muis hoofd-en-body restrainer. Het lichaam van de muis wordt beperkt met behulp vaneen kunststof cilindrische buis met een diameter van 35 mm. Het hoofd van de muis wordt geïmmobiliseerd door het aansluiten van de sokkel van de muis om de ijzeren staaf met twee schroeven. De ijzeren staaf een hoek van 30 graden om de kop van de muis te positioneren in de normale toonhoogte tijdens het lopen. * Bovenaanzicht van het voetstuk met twee moeren. Figuur 2. Schematische tekening van de muis video-oculografie setup. Figuur 3. De kalibratie van de video-leerling-volgsysteem. A) De camera is geroteerd meermalen + / – 10 ° (bijvoorbeeld 20 graden piek) rond de verticale as van de draaitafel. De gevolgde pupil (P) en het referentiesignaal cornea reflectie (CR) voor de uiterste standen van de camera rotatie worden gebruikt om de draaiingshoek van de pupil berekenen(Rp). B) De straal van de pupil diameter afhankelijk is van de grootte van de pupil. C) Voorbeeld de invloed van pupilgrootte op pupil positie tijdens de kalibratieprocedure (beide gemeten in pixels (px)). D) Relatie tussen Rp en leerling middellijn, gemeten in een enkele muis. De dertien pupil diameters uitgevoerd door het veranderen van de intensiteit van het omgevingslicht. Figuur 4. Meten en analyseren van oogbewegingen met behulp van video leerling-tracking. A) De hoek pupil positie wordt berekend uit de straal van de pupil (Rp) en de positie van de pupil (P, gecorrigeerd voor CR positie). B) Voorbeeld van compenserende oogbewegingen veroorzaakt door het stimuleren van de vestibulaire en visuele systeem (visuele verbeterde VOR). De draaitafel was gedraaid sinusvormig op 0,6 Hz met een amplitude van 1,6 °, terwijl de omliggende scherm was goed verlicht. C) Analyses van de opnamezie B). De grafiek toont de gemiddelde snelheid spoor van de draaitafel (blauw) en pupil (rood). Met deze gemiddelde sporen werden uitgerust met een sinusfunctie (zwart). Figuur 5. De prestaties en het leren van het oculomotorische systeem gemeten in een C57Bl6 muis. A) Oogbewegingen worden gegenereerd door rotaties van de omringende scherm (optokinetische reflex: OKR, top-panelen), door het draaien van de muis in het donker (vestibulo-oculaire reflex: VOR, midden panelen) en door het draaien van de muis in het licht (visueel versterkte vestibulo-oculaire reflex: VVOR, onderste paneel) met frequenties 0,2 tot 1,0 Hz bij een amplitude van 1,6 °. De versterking van de reflex werd berekend als de verhouding van het oog snelheid stimulus snelheid (links panelen) en fase van de reflex werd berekend uit het faseverschil tussen het oog snelheid en stimulus snelheid (rechter panelen). B) Motor learning werd bereikt door adaptief het verhogen van de VOR met behulp van een uit fase opleiding paradigma. De muis is onderworpen aan een visuovestibular training paradigma waarin de rotatie van de muis die was fase (180 °) met de rotatie van de omringende scherm (zowel roterende 1,0 Hz, 1,6 °) veertig minuten. Elke 10 minuten is de VOR werd getest (1,0 Hz, 1,6 °). In deze muis de uit fase opleiding verhoogde de VOR winst. Movie 1. Animatie over de paradigma dat OKR induceert bij muizen Klik hier om film te bekijken . Movie 2. Animatie over de paradigma dat VOR induceert in de muis. Klik hier om film te bekijken . Movie 3. Animatie over de paradigma dat VVOR in muizen veroorzaakt..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Klik hier om de film te bekijken. Movie 4. Animatie over de visuovestibular uit fase opleiding paradigma dat VOR aanpassing (verhoging) bij muizen veroorzaakt. Klik hier om film te bekijken .