다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상
概要
NADPH 산화 효소가 phagocytes에서 반응성 산소 종의 주요 소스 (ROS)입니다. 때문에 ROS의 임시 자연의, 그것은 생활 동물의 ROS 수준을 측정하고 모니터링하기가 어렵습니다. 생활 쥐 ROS의 일련 정량화하기위한 최소한 침입 방법 설명되어 있습니다.
Abstract
NADPH 산화 효소는 항균 및 항 곰팡이 호스트 방어를 mediates 중요한 효소이다. 항균 호스트 방어에서의 역할뿐만 아니라, NADPH 산화 효소는 염증 반응 1 변조 중요한 신호 기능이 있습니다. 따라서, NADPH 산화 효소 파생 ROS 생성의 "실시간"동역학에 측정 할 수있는 방법의 개발은 방위, 염증, 그리고 부상을 개최 할 관련 메커니즘을 이해하는 중요한 연구 도구가 될 것으로 예상된다.
만성 granulomatous 질환 (CGD)는 심각한 감염과 과도한 염증을 특징으로 NADPH 산화 효소의 상속 장애입니다. 식세포 NADPH 산화 효소의 활성화는 cytosolic subunits (p47 phox, p67 phox, 그리고 p40 phox)과 막에 바인딩 flavocytochrome (gp91 phox와 P22 phox heterodimer로 구성)에 RAC의 translocation이 필요합니다. 손실CGD에서 이러한 NADPH 산화 효소 구성 요소 결과의의 기능 변이. CGD 환자와 마찬가지로, gp91 phox – 결함 마우스와 p47 phox – 결함 마우스에 결함이 식세포 NADPH 산화 효소 활동 및 장애인 호스트 방어 13, 14가 있습니다. 위에 설명 된 NADPH 산화 효소의 구성 요소가 포함 phagocytes,뿐만 아니라 다른 세포 유형의 다양한 NADPH 산화 효소의 다른 isoforms을 표현한다.
여기, 우리는 생활 마우스에서 ROS 생산을 수량화하고 염증과 부상의 모델에서 ROS 생성에 NADPH 산화 효소의 노력이 윤곽을 그리다 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 전하 결합 소자 (CCD)에 의해 기록되어 발광을 방출하기 위해 L-012 (루미놀의 아날로그)와 반응 ROS에 기반을두고 있습니다. L-012 프로브의 원래 설명에, L-012에 따라 달라 chemiluminescence은 완전히이 반응에서 검색된 메인 ROS는 슈퍼이라고 표시, 초과 산화물의 dismutase에 의해 폐지되었다산화물 음이온 15. 후속 연구는 L-012은 반응성 질소 종 16, 17 등 다른 자유 래디칼을 감지 할 수 것으로 나타났습니다. Kielland 외. 17 phorbol myristate 아세테이트, NADPH 산화 효소의 강력한 활성,의 주제 응용 프로그램이 발광 프로브 L-012를 사용하여 마우스에서 발견 할 수 산화 효소에 의존 ROS 생성을 NADPH는 생각이 들어서 보여 주었다. 이 모델에서, 그들은 L-012-의존 발광는 p47 phox – 결핍 생쥐에서 폐지 된 것으로 나타났다.
우리는 wildtype 마우스와 NADPH 산화 효소 – 결함 p47 phox-/에서 ROS 생성 비교 – 다음과 같은 세 가지 모델의 생쥐 2 : zymosan, NADPH 산화 효소를 활성화 할 수 있습니다 벽 파생 제품 프로 염증 곰팡이 세포의 1) intratracheal 관리, 2) cecal 결합과 주사 (CLP), 보조 급성 폐 염증과 부상으로 간 복부 패혈증의 모델, 그리고 3) 구두 탄소 tetrachloride에게(CCL 4) ROS에 의존 간 부상의 모델입니다. 이 모델은 특히 각각, 비 전염성 염증, polymicrobial 패혈증 및 독소 유발 장기 부상의 맥락에서 NADPH 산화 효소에 의존 ROS 생성을 평가하는 선정되었다. p47에 wildtype 마우스에 bioluminescence을 비교 phox-/ – 마우스 우리는이 모델의 발광 생물 신호에 p47 phox 함유 NADPH 산화 효소에 의해 생성 된 ROS의 특정 공헌을 윤곽을 그리다 수 있습니다.
p47에 비해 wildtype 쥐 증가 ROS 수준을 보여 Bioluminescence 이미징 결과는 phox-/ – 마우스는 NADPH 산화 효소는 염증 자극에 대한 응답으로 ROS 생성의 주요 원천입니다 지적했다. 이 방법은 생체 내 염증 동안 ROS 생성의 "실시간"모니터링을위한 최소한 침해 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
Discussion
생활 동물 반응성 산소 종의 "실시간"측정 (ROS)는 형광등과 chemiluminescent 프로브를 사용하여 달성 될 수있다. 형광 프로브가 약 신호 대 잡음 비율 12 문제에서 고통 있지만, 설명 된 이미징 기술은 루미놀 기반의 기판 L-012와 ROS의 화학 반응에 따라 발광을 검출에 대한 더 많은 문자를 구분합니다. 모든 발광 생물 이미징 기술과 마찬가지로,이 방법론은 기관과 조직에 의해 파장에 의?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH RO1 AI079253 및 보훈학과로 운영되었습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | コメント |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
参考文献
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 .
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y, ., Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
