リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。
胚の脊髄は中枢神経系(CNS)のニューロンとグリア細胞の大部分を生じさせる神経前駆細胞をサイクリングで構成されています。ずっとそのパターン脊髄を分子メカニズムについて知られ、ニューロンの分化1、2を引き出すされていますが、我々は、細胞の挙動のレベルでこれらの初期のイベントの深い理解を欠いている。彼らは神経を受けると、それはリアルタイムで神経前駆細胞の挙動を研究するため、非常に重要です。
過去には、初期胚組織のリアルタイムイメージングは、細胞/組織培養中の生存率と同様に蛍光イメージングの光毒性影響によって制限されていました。ここでは、新規のex vivoでのスライス培養プロトコルと広視野蛍光顕微鏡( 図1)を利用し 、長時間のイメージングなどの組織のための新規アッセイ法を提示します。このアプローチでは、ニワトリ胚の長期的な時間経過のモニタリングを実現高い空間分解能と時間分解能を持つピナル脊髄前駆細胞。
このアッセイは、画像に携帯電話とサブセルラー行動の観察に加えて、胚組織3、4の範囲を変更することができ、遺伝子活性のための新規の開発と高感度レポーター(例えば、Notchシグナル伝達5)は 、このアッセイを行うシグナル伝達を理解するための強力なツールでは、胚発生過程における細胞挙動を制御します。
ここではニワトリ胚スライス培養における細胞の挙動を監視するための新たなタイムラプスイメージングアッセイを提示します。 24-48時間の間の時間フレームをキャプチャすることが容易であるが、このアッセイでは、最大70時間の生体組織の高分解能イメージングを可能にします。高NA油浸対物と時間点の間の比較的短い間隔での使用は同様に私たちはしばしば急速に発生する細胞の挙動を監視することができますように、高解像度での画像取得を可能にし、容易に焦点を用いた従来のタイムラプスイメージング中に見逃されることができ顕微鏡。
このアッセイの主な利点は、長期間にわたって画像セルの能力である。 7顕微鏡を共焦点レーザーの代わりにワイドフィールド6の使用はこのために重要です。共焦点顕微鏡は、従来の光学切片をとり、直接フォーカス情報のうち、排除する能力を含む、広い視野顕微鏡に比べていくつかの利点を提供してきました<sup> 7しかし、ピンホールの使用は、大量の情報を除いて、長い露光時間を必要と、検出器8への光の損失につながる。広視野顕微鏡は、他の一方で、完全な視野照明を使用して、目的を介してすべての通過する光は、検出器に送られます。高い量子効率を持つこの結合は、結合素子(CCD)カメラ、非常に高速な露光時間と共焦点顕微鏡9に比べて対ノイズ比の高い信号を画像処理を確実に冷却した。このアプリケーションでは、我々は長い期間、記録の3Dスタック、最終的に小型に近い回折制限された構造を解決するためのイメージする必要があります。共焦点顕微鏡は、これまでに検出器に到達するからアウトフォーカスの光を防ぎ、大幅に厚い、高密度で標識した試料7、8のバックグラウンドを減少させるが、それだけでよりもはるかに大きな光入力で使用可能な信号対雑音比を実現ワイドフィールド顕微鏡10。非常に光に敏感なsparselのために私たちのエレクトロ脊髄のスライスのようにy軸ラベルのサンプルは、したがって、広い視野顕微鏡は、共焦点顕微鏡よりもパフォーマンスが向上します。フォーカス情報と向上し、コントラストの外に除去しデコンボリューションによって、イメージの復元と組み合わせると、広いフィールドが、小さな、薄暗いオブジェクト11の検出に特に適しています。あらゆる組織のイメージング実験には適していませんが、このアプローチは、私たちの生細胞イメージングアプリケーションのための非常に有効であった。
蛍光タンパク質の選択は、細胞の生存に影響を与えることができる重要な要因である。我々は最良の結果がマーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)12を使用して構造体から得られることがわかります。我々は現在、事実上のデュアルチャネルの時間経過のためにGFPと組み合わせて使用することができる赤色蛍光タンパク質の範囲を評価しています。 13利用できるようなタンパク質の様々なものがあります。多くのタンパク質は、蛍光タンパク質との融合体として安定しているが、、いくつかのタンパク質が減少し、細胞生存率の結果、融合によって不安定にレンダリングすることができます。このような場合には、内部リボソーム侵入部位(IRES)を含む構造体の使用は、蛍光タンパク質から目的のタンパク質を分離するのに便利です。
イメージング脊髄スライスする場合は、注意が蛍光灯への暴露を最小限に抑えるように注意する必要があります。顕微鏡の接眼レンズは、スライスを見つけて位置する透過光(明視野)でのみ使用する必要があります。蛍光画像は、常に最小の露光時間を使って顕微鏡ソフトウェアを使用して取得する必要があります。これらは5から50 msの範囲に保たれるべきであり、中立的な密度のフィルタの使用で実験する必要があります。長い露光時間が最初にクリアな画像を生成するかもしれませんが、蛍光灯暴露の光毒性効果は、細胞死につながる可能性があります。この地域は中に損傷されている可能性があり、組織が含まれているカバースリップに最も近い組織の最初の5〜10μmの撮像すべきではありませんスライス。
ここで示す例は、HHステージ10以降撮像された6-7時間でエレクトロ胚のですが、このメソッドは、ステージ18をHHに胚用に使用することができます。後の段階で、脊髄組織がはるかに大きいので、手でスライスすることは困難である。これらのケースでは、低融点アガロースで胚を埋め込み、ビブラトームで切片と良い結果をもたらす可能性があります。我々が開発して脊髄のイメージング細胞の方法として、このアッセイを提示するにもかかわらず、このアプローチはまた、感覚placodes 3を含むイメージを他の胚組織に変更されています。
The authors have nothing to disclose.
Reagent | Company | Catalogue number | コメント |
WillCo Dish | WillCo Wells | GWst-3522 | |
poly-l-lysine | Sigma | P8970 | 0.1% in Tris |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Instruments | GC100-10 | 1.0mm outer diameter, 0.58mm inner diameter |
Electrodes (Genetrodes, in ovo, L-shaped | BTX | 10-001850-01 | 5mm gold plated |
ECM 830 square pulse generator | BTX | 45-0002 | for in ovo electroopration |
Fast Green | Sigma | F7258 | |
Type I rat collagen | Sigma | C3857 | |
L-15 medium (powder) | Sigma | 2.76 g/L in distilled water for 5x solution |
|
Sodium bicarbonate | Sigma | S8761 | 7.5% solution |
Neurobasal medium | Invitrogen | 12348-017 | without phenol red |
Glutamax | Invitrogen | A1286001 | 100x solution |
B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15710049 | 10 mg/ml |
L15 medium (liquid 1x) | Invitrogen | 11415-049 | |
Microknife | Altomed | A10102 | 15 degree incline |
Stainless steel headless pins | Watkins and Doncaster | E6871 | A1 size |
Sylgard 184 elastomer | VWR | 634165S | |
DeltaVision Core microscope system | Applied Precision | ||
Coolsnap HQ2 CCD camera | Photometrics |