Procedimento Experimental: 1. Transfecção utilizando Amaxa rato célula T Nucleofector Kit Descrevemos aqui o transfecção de ingênuo ou in-vitro ativados pilhas de T com plasmídeos de expressão que codificam moléculas sinalizadoras marcados por GFP, usando o mouse Amaxa célula T Kit Nucleofector. In-vitro a activação de células T utilizando péptido-carregados APCs esplénicas é realizada como descrito antes 7. Todas as células T utilizadas nos nossos estudos expressar o TCR e que reconhece MCC péptido (88-103) ligado à molécula de MHC IE k. A transfecção é efectuada essencialmente de acordo com as recomendações do fabricante, no entanto, apresentam-se alguns dicas que promovem a viabilidade das células T após a transfecção. Tanto a viabilidade e eficiência de transfecção é muito maior em in-vitro de células T activadas do que nas células naive. Antes de começar, preparar 2 mL de meio de células T suplementado pela adição de 20 uL deambos os componentes do meio A e B e 100 uL de soro fetal de bovino (5%) para cada transfecção a ser executada. Equilibrar o meio em uma placa de 12 poços num humidificada 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante pelo menos uma hora. Alternativamente, alíquotas de meio suplementado com soro de 5% e um componente podem ser preparados e armazenados congelados. Se este for o caso, descongelar o número necessário de alíquotas, adicionar o Componente B, e executar o equilíbrio. – Pré-equilíbrio do meio é muito importante, como a morte celular irá resultar da re-suspensão de células após a transfecção em meio que é frio ou tem um pH diferente de 7,2. Em seguida, preparar a mistura de transfecção. Combinar 82 uL de rato Solução Nucleofector célula T com 18 uL de Suplemento 2 e 5μg de DNA de plasmídeo (concentração não inferior a 0,5 ug / uL). Misturar bem tocando o tubo ou com o uso de micro pipeta. -É importante para realizar uma titulação da dose do plasmídeo por um número fixo de células para cada constructo a ser utilizado para a transfecção. Para algumas construções maiores, mais DNA pode ser necessária. DNA deve ser livre de endotoxinas. Transferência de 5 a 10 milhões de células a um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. Remover o máximo do sobrenadante quanto possível, com um aspirador de vácuo. – Os fabricantes recomendam a girar as células a menos de 90x g, no nosso caso, essa velocidade corresponde a 75x g. O escolhido força centrífuga relativa (RCF) para se obter um sedimento celular é talvez o mais importante variável, tal como centrifugação a RCF baixa impede danos para a membrana celular. Re-suspender o sedimento de células na mistura de transfecção por pipetagem suave e lentamente o pellet celular até que não haja grandes aglomerações de células restantes. Isto pode geralmente ser realizada por completamente aspiração das células Through a ponta da pipeta não mais do que 3-4 vezes. Usando uma pipeta, transferir cuidadosamente a suspensão para uma cuvete Amaxa certificada, assegurando que não existem bolhas de presentes. Tapar o cuvete. Seleccione o programa Nucleofector X-001 no dispositivo de Nucleofector. Insira a cubeta no suporte Cuvette Nucleofector e aplicar o programa selecionado. – Depois electroporating das células, o melhor é imediatamente transferi-los para o meio de cultura pré-equilibrada. Os fabricantes recomendam que as células ser mantido no meio de nucleofector por não mais do que 15 minutos. Traga a cuvete e do pré-equilibrada, meio de cultura suplementado totalmente para a capa. Usando a pipeta de plástico fornecidos, adicionar cerca de 500 uL do meio para a cuvete e transferir a suspensão de célula para o meio na placa gota a gota. Incubar as células a 37 ° C durante 4 horas antes de imagem. Células naive são incubated a 30 ° C em vez de 37 ° C. Isto ajuda a manter a sua reactividade ao antigénio. – Três a quatro horas de incubação são geralmente suficientes para as células T a detectavelmente expressar a GFP proteínas marcadas. Optou-se por células de imagem, neste ponto do tempo, porque o nível de expressão é baixa e artefactos de sobre-expressão deve ser minimizada. Se a sobre-expressão de uma proteína particular é desejado, no entanto, as células T deve ser removido a partir do meio Amaxa após 4 horas. Isto é conseguido através de novo peletização as células a RCF baixa e ressuspensão em pré-equilibrada meio de cultura de células T suplementado com 50 U / mL de interleucina 2 (IL-2) a uma densidade de 2 milhões de células / mL. 2. Microscopia TIRF Descrição do microscópio TIRF: Gerais de configuração: Optical componentes foram construídos em torno de um microscópio de fluorescência Olympus IX71 que foi originalmente equipado com um módulo TIRF Olympus. Logo discovered efeitos cromáticos neste módulo, quando um estado único alinhamento não conseguir colimação coincidente para linhas de laser de diferentes comprimentos de onda. Este módulo, portanto, não permitiria a imagem TIRF simultânea em comprimentos de onda de excitação diferentes, e nos propusemos a construir um aparelho TIRF personalizado que minimiza os efeitos cromáticos no sistema, como discutiremos em detalhes nas seções seguintes. O método aqui descrito foi desenvolvido para a ampliação 150 X, 1,45 abertura numérica (NA) TIRFM objetivo (Olympus), mas funciona tão bem para a ampliação X 60, 1,45 versões de NA. Para a iluminação de campo de largura, o microscópio está ligado a uma fonte de luz haleto de metal Lambda-XL e uma roda de filtro de excitação (Sutter Instruments) equipado com filtros de excitação. Para o posicionamento automático da fase de amostra em relação ao objectivo, o microscópio é equipado com uma tradução XY motorizado, piezo-controlada Z fase (ASI). As imagens são capturadas através de dois Qu idênticoAntem elétrons Multiplicando (EM) câmeras CCD (Photometrics). O tamanho do pixel dessas câmeras combina muito bem com a ampliação oferecida pelo 150 objetivo TIRF X, dando uma resolução final de 0,1 mM por pixel. As câmeras também oferecem EMCCD a sensibilidade de visualizar transf GFP com nível de baixa expressão. Lasers: Para TIRF iluminação, um sistema de entrega de 5 lasers um total de 6 linhas de laser (405 nm, 440, 488, 514, 561 e 640) está acoplado a uma fibra monomodo (Technologies Solamere). O laser de Árgon e 561 nm diodo bombeado de estado sólido (DPSS) laser (linhas 488, 514 e 561) são encaminhados através de uma fibra acusto-óptica sintonizável (AOTF) para controlo de intensidade enquanto a intensidade dos lasers de diodo (405, 440 e 640 nm) é controlado por tensão do modulador de suas fontes de alimentação. A tensão na AOTF e as fontes de alimentação dos lasers de diodo é controlado através de uma placa de aquisição de dados (DAC) placa (Measurement Computing), utilizando MetaMorph software (moleculareslar Devices). A eficiência de acoplamento para os lasers de diodo é de 30% enquanto que as dos lasers de árgon e DPSS são aproximadamente 60%, devido aos seus diâmetros menores do feixe. TIRF módulo: A fim de simultaneamente a imagem do TCR e suas moléculas de sinalização associadas, como descrito anteriormente, foi essencial ter TIRF iluminação que foi cromaticamente corrigida e que não exigiria realinhamento ou recentragem na aquisição de emissões de fluorescência de comprimentos de onda diferentes. TIRFM foi conseguida utilizando através-da-objectivo de iluminação, como descrito anteriormente 17. O cabo de fibra óptica que fornece luz de laser para o microscópio foi fixada em um lançamento de fibra equipado com um suporte de fibra XY, montado sobre um carril micrómetro óptico orientado para Z ajustamento (Thorlabs). Para alcançar TIRF iluminação, o feixe de laser é focada no plano focal posterior da objectiva, usando um sistema de duas lentes (L1 (colimação da lente) e L2 (lente de focagem) na Figura 1), de modo que o beam surge colimado do objetivo. Isto assegura que todos os raios de luz que sai do objectivo terá o mesmo ângulo em relação ao plano da amostra. A ponta da fibra óptica é posicionada no foco da lente de colimação. Ao mover o micrómetro óptico ao longo do carril em relação à lente colimadora (na direcção Z) é possível ajustar a focagem do feixe e mover o feixe em X e Y posição usando os botões de ajuste XY. Devido à volta da abertura muito pequena do objectivo X 150, descobrimos que, para alcançar TIRF, o tamanho do ponto de laser no plano focal posterior necessário para ser pequena. Para alcançar o foco necessária para produzir a pequena mancha, as lentes de comprimento focal curta eram necessárias (Keir Neumann, comunicação pessoal), daí, utilizou-se uma lente de focagem com uma distância focal de aproximadamente 108 mm que foi colocado no cubo dicróico imediatamente anterior o objetivo. A lente de colimação foi colocado mais perto do divisor de feixe que trouxe na TIIluminação RF. Para minimizar os indesejáveis efeitos cromáticos, usamos doublets acromáticas (lente cromaticamente corrigido feita por elementos fundindo dois lentes feitas de materiais de diferentes índices de refração) com revestimentos anti-reflexo, tanto para a colimação e focagem com lentes (JML óptica). O foco pode ser verificado através da verificação de que o feixe colimado emerge fora do objectivo quando posicionado no centro da abertura para trás e devem formar um ponto apertado no tecto do quarto. A posição do ponto focado é então movido para a borda da abertura (na direcção Y), que faz com que o feixe convergir para o plano de imagem em grandes ângulos, e eventualmente, o ângulo crítico para a reflexão interna total é alcançada. Usando estes componentes ópticos, obtivemos colimação simultânea para todos os comprimentos de onda de 442 a 640 nm no mesmo alinhamento. Um alinhamento óptico único, por conseguinte, permitiu-nos para executar simultaneamente ao longo de TIRFM múltiplos comprimentos de onda. Appar câmera duplaATUS: aquisição simultânea da emissão de fluorescência distinta resultante de dois fluoróforos diferentes foi conseguida através da construção de um sistema de câmara dupla que divide a emissão em duas gamas de comprimento de onda através do uso de espelhos dicróicos (Figura 2). Luz emitida é reflectida a partir do objectivo para fora da porta do lado direito do microscópio. Como a maioria dos objectivos são infinito corrigida (com imagens formadas ao infinito), uma lente de tubo é necessário para focar a imagem. Para manipular dois comprimentos de onda de emissão simultânea, a lente tubo na porta do lado direito foi removido. Um adaptador personalizado contendo c-mount tópicos (Sutter Instruments) foi anexada e ligada a um detentor espelho dicróico (Edmund Optics). Espelhos dicróicos que separam a emissão de GFP do de corantes orgânicos utilizados para etiquetar o TCR (Alexa546, Alexa647, etc) foram instaladas no presente titular. Este módulo foi seguido, em ambos os caminhos de luz por um tubo de suporte de lente, um suporte de filtro de emissão e os tubos de extensão. OAs lentes de tubo (TL1 e TL2 (Figura 2)) têm um comprimento focal de 180 mm. As lacunas nos tubos de extensão que levam para as câmeras CCD moeda electrónica foram cobertas com papel preto para proteger as câmeras de luz difusa. Para permitir o alinhamento dos dois canais, as câmaras foram montadas em dois suportes de tradução personalizados XYZ (Produtos Holmarc). Abaixo descrevemos como alinhar o microscópio para dois canais de imagem simultânea. Os passos envolvidos são alinhando a iluminação TIRF, ajustando a potência do laser, e alinhar as duas imagens de saída utilizando a resolução sub-micropérolas. Antes de começar, todos os componentes do microscópio estão ligados. O computador e software são então iniciado e é assegurado que todos os componentes de hardware são reconhecidos pelo software. Para utilização como um padrão de co-localização, diluir 1 uL de sub-resolução (0,2 um) Fluoresbrite Multi-fluorescente Microesferas em 2 mL de PBS e adicionar 0,25 mL da microesferasuspensão a cada poço de uma II Lab-Tek 8-bem câmaras sistema lamela (Nunc). Coloque o sistema de slide câmara para a plataforma acima do objetivo. Grânulos que são adsorvidos ao vidro são então postos em destaque. Usando o alinhamento Y do lançamento de fibra XYZ, a posição do feixe de laser é movido para o centro da abertura de trás do objectivo. É importante fazer isso, quando o objectivo é na posição onde o plano de vidro é em foco. Se o feixe não é colimada, o micrómetro Z é ajustada para atingir colimação completa. Colimação é testado individualmente para todas as linhas de laser a ser utilizadas na experiência. Nesta fase, a potência do laser, para cada linha é medido usando um medidor de energia laser e é ajustado a 20-30 mW em cada canal. -T células são extremamente sensíveis à radiação de laser, ea iluminação está limitada a um total de 50 mW. Imagens das esferas são adquiridos por meio TIRF ILLUMINATíon no modo ao vivo. Ligue o micrómetro Y-alinhamento sobre o lançamento de fibra de modo a que o feixe começa afastando-se do limite máximo até que o seu ângulo com respeito às abordagens o objectivo do eixo óptico 90 graus. Eventualmente, quando o ângulo crítico para a TIR, é atingido, a luz do laser já não sair do objectivo. Alinhamento TIRF é então julgado por focagem cima e para baixo através do plano da lamela. Se grânulos que estão flutuando em solução pode ser visualizado, em seguida, o ângulo do feixe no que diz respeito às necessidades objectivas normais de ser aumentada ainda mais. No alinhamento TIRF correcta, apenas um plano óptico estarão em foco (isto é, apenas as pérolas que são adsorvidas à lamela). Um teste mais fina do alinhamento TIRF pode ser implementada quando as células T de imagem marcadas com um corante de superfície que se espalhar sobre uma superfície. (Ver ponto 3.4). Depois de iluminação TIRF tenha sido alcançado, os dois canais podem ser alinhadas com relação um ao outro. Focar os grânulos e comparar a posição do icaracterísticas dentifiable nas imagens produzidas em ambos os canais. Usando o X e Y parafusos micrómetros em um suporte para a câmara, trazer a posição relativa dos grânulos em como a proximidade estreita quanto possível. Salve as imagens de ambos os canais. Estas imagens será utilizado como um padrão de co-localização para alinhar os dois canais. As câmaras também precisam de ser alinhadas de modo que eles são parfocal com respeito a um outro. Isto é conseguido através da aquisição de um conjunto de imagens das pérolas de resolução de sub que são separados um do outro na direcção Z de 100 nm. Se o pixel intensidade máxima para as pérolas se situa no plano mesma para ambas as câmaras, em seguida, eles são parfocal. 3. Imagem Uma vez que o microscópio está configurado, a próxima tarefa é preparar câmaras de fluxo contendo bicamadas lipídicas de vidro apoiadas apresentam moléculas de antigénio e de adesão, como descrito anteriormente 6 e em seguida, executar TIRFM de células T transfectadas interagindo com osubstrato. A bicamada publicado protocolo 5-6 foi seguido tal como publicado, excepto que os lipossomas não foram incubadas durante 20 minutos sobre a lamela após a câmara de fluxo foi montado. Em vez disso, HBS-BSA tampão foi fluiu na célula de fluxo imediatamente após a montagem. Montar uma câmara de fluxo com bicamadas lipídicas planas formadas na lamínula de vidro contendo Ni-NTA lipídios. As moléculas de adesão, ICAM-1 (100 moléculas / iM 2), e péptido-MHC complexos, MCC carregado IE k (moléculas 5-10 / iM 2), são incorporados na bicamada via suas etiquetas de histidina. A co-estimulatório molécula CD80 é adicionado usando uma âncora de GPI (100 moléculas / iM 2). Coloque a célula de fluxo sobre a fase do microscópio e estabilizá-la. Anexar o fabricante fornecido elemento de aquecimento sobre a célula de fluxo para controlar a sua temperatura. Posicione o objetivo em uma bicamada e trazer o avião bicamada em se concentrar. Habilitar aquecimento do objectivo e do fluxocélula para estabilizar a temperatura da câmara a 37 ° C. Transfectadas As células T são peletizadas após 4 horas de incubação a uma velocidade de 80x g, e re-suspensas em HBS-BSA e tampão suplementado com 10 ug / mL de H57 Fab ou 20 ug / mL de H57 único fragmento variável de cadeia (scFv) para etiquetar o TCR. As células são então injectados nas células de fluxo. Imagens é feito na presença contínua do Fab ou scFv, devido à sua alta constante de dissociação. A sua presença no meio não aumenta significativamente o fundo como o campo TIRF é muito fina. Condições de imagem estão configurados de modo que a aquisição de dois canais ao vivo mostra uma visualização ao vivo dos canais de TCR e GFP que ajuda na busca de células transfectadas. TIRF iluminação é confirmada por concentrando-se o plano de vidro para detectar qualquer coloração da membrana lateral. Se membranas laterais não entram em foco, em seguida, o alinhamento TIRF é bom. As células transfectadas são então trabalhada uma vez ou em uma sequência de imagens para produzir videos. 4. Processamento de Imagens e de Análise de Dados O software exibe imagens das duas câmeras em um único frame. A saída de cada câmara é de 512 x 512 pixels, daí, a imagem de saída é de 1024 x 512 pixels de tamanho. As imagens primeiro precisam de ser dividida em quadros individuais correspondentes às duas câmaras. As imagens de resolução de sub-grânulos a partir dos dois canais são sobrepostas e os parâmetros de alinhamento são determinados. Uma característica específica para o nosso sistema é uma rotação grau 1 de um canal com respeito ao outro (ver Figura 3). A fonte mais provável dessa rotação são os suportes da câmara. Após esta rotação adicional relativa transformação linear em X e Y têm de ser realizados para alinhar perfeitamente os grânulos com respeito ao outro. Imagens das pérolas são obtidos em cada experiência para determinar os parâmetros precisos para alinhar os dois canais. Estas transformações lineares e rotacional são, então, aplicado a todos osimagens e, em seguida, eles estão sujeitos aos algoritmos de segmentação e análise de co-localização. 5. Os resultados representativos O sistema aqui descrito pode ser adaptado para estudar a jusante de sinalização de qualquer receptor na membrana plasmática. É particularmente informativa no estudo TCR sinalização porque sinalização ocorre em aglomerados opticamente resolvidos chamados TCR microclusters ou em endosomas como descrito recentemente 18. Se sinalização ocorreu em resolução sub-grupos de receptores ou em un-cluster receptores experimentos adicionais teria que ser feito para interpretar os dados. Como mencionado antes, os CD3 cadeias do complexo TCR sofrer fosforilação por Src quinase família Lck sobre envolvimento do TCR pelo péptido-MHC complexos. A cadeia CD3ζ fosforilada então recruta o quinase família Syk ZAP70. Visualizando o recrutamento de Zap70, assim relata o estado de fosforilação da cadeia CD3ζ. A força de estimulação TCR pode ser alterada utilizando peptídeos mutantes com os resíduos de contacto de TCR. Tais péptidos são chamados alterados ligandos peptídicos (APL). Uma experiência representativa é mostrado na Figura 4, onde os péptidos agonistas robustamente recruta ZAP70 para microclusters TCR enquanto o menor potência péptido T102L falhar para recrutar ZAP70 para TCR microclusters, demonstrando que a cadeia CD3ζ não é fosforilada no presente caso. Nós poderíamos chegar a essa conclusão porque tivemos que apenas observar o recrutamento de ZAP70 a clusters de TCR, que foram facilmente detectados pelo TIRFM. Um algoritmo de segmentação automatizado foi usado para contar o número de ZAP70 microclusters por célula. Também é mostrado no filme complementar é a gravação simultânea de TCR e associados ZAP70 fluorescência. Observe a natureza dinâmica da lamelipodium. <br /> Figura 1. Imagem e esquemática do lançamento TIRF personalizado. O painel A mostra a fotografia do lançamento TIRF como instalado no microscópio, e Painel B é um diagrama esquemático do lançamento TIRF demonstrando o caminho da luz. O esquemática e imagem mostrando a posição da lente colector, o divisor de feixe, o lançamento de fibra com X, Y e Z ajustamentos, a L1 lentes de colimação, ea focagem da lente L2 instalado no cubo dicróico e com o objectivo TIRF. A inserção mostra a lente de focagem instalado no cubo dicróico. Figura 2. Imagem e esquemática do sistema de câmara de dois. O painel A mostra a fotografia do sistema de câmara de duas como acoplada ao microscópio, e Painel B é um diagrama esquemático do mesmo. O esquema e imagem mostram a posição do objetivo, espelho, dicróica, TL1 e TL2 tubo lentes, filtros de emissão de F1 e F2, as duas câmeras C1 e C2 em therdeiro está com o seu respectivo X, Y e Z ajustes. Figura 3. Uso de sub-resolução pérolas para alinhar os dois canais. Painéis A e alinhamento sobreposições mostram B de resolução sub-esferas antes (Painel A) e após (Painel B). O painel A mostra que um dos canais é rodado em relação ao outro. Painéis C e D são uma sub-seção de imagens de A e B. Painel E mostra uma imagem de sobreposição de dois canais de células sem tratamento. Parâmetros de alinhamento utilizados no painel D foram aplicados à imagem mostrada no painel de Aviso F. como o lamelipodium a partir dos dois canais está perfeitamente alinhado em F do painel e não no painel de barra de escala E. 4 mm para todos os painéis. Figura 4. ZAP70 recrutamento para TCR microclusters em resposta a APLs diferentes. In-vitro activado e T As células foram transfectadas com um plasmídeo que codifica ZAP70 fundido a GFP e foram incubadas em vidro apoiados Ni-NTA bicamadas contendo 6 moléculas / iM de péptido carregado 2 His-tag-IE k, 100 moléculas / iM de 2 Alexa647 conjugado His-tag ICAM- 1 e 100 moléculas / mM 2 de GPI-ancorada CD80. Os péptidos carregados estão indicados na inserção. ICAM-1 refere-se a células em bicamadas contendo 100 moléculas / iM de 2 Alexa-647 conjugado His-tag ICAM-1. De canal duplo simultâneo aquisição microscopia TIRF foi realizada na presença contínua de Alexa546 conjugado fragmento Fab H57 (não bloquear) para corar o TCR. As células foram visualizados até uma hora após o contacto inicial com a bicamada. Números de ZAP70 clusters por célula foram analisadas utilizando um software de contagem automatizada cluster. Pelo menos 40 células foram analisadas em cada caso. Barra de escala 2 mm para todas as imagens. 92/3892fig5.jpg "/> Figura 5. Alinhamento do sistema de câmara dois utilizando dois tipos diferentes de câmaras. Este painel mostra a sobreposição alinhada de resolução sub-contas fotografada usando o sistema de câmara dois, onde as duas câmeras possuem tamanhos de pixel diferentes (verde: 6,45 mM tamanho do pixel fotografado em binning 2×2 e Vermelho: tamanho do pixel 16 mM fotografada sem binning). Inserção mostra a vista ampliada da caixa quadrada no centro do campo. Barra de escala 5 mm. Filme Suplementar. ZAP70 recrutamento para microclusters TCR em resposta ao peptídeo agonista. In-vitro e as células T activadas foram transfectadas com um plasmídeo que codifica ZAP70 fundido a GFP e foram incubadas em vidro apoiados Ni-NTA bicamadas contendo 6 moléculas / iM de péptido carregado 2 His-tag-IE k, 100 moléculas / iM de 2 Alexa647 conjugado His-tag ICAM-1 e 100 moléculas / 2 mM de GPI-ancorada CD80. Canal duplo simultâneo umaQUISIÇÃO microscopia TIRF foi realizada na presença contínua de Alexa546 conjugado fragmento Fab H57 (não bloquear) para corar o TCR. Um campo de células transfectadas foi repetidamente fotografada 40 vezes com uma resolução de tempo de 10 segundos por quadro. Barra de escala 2 micra. Clique aqui para ver filme suplementar .
