Méthode pour l'isolement et l'identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d'extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

Préparation Expérience Avant de commencer l'expérience, il est essentiel d'avoir tous les réactifs, les contenants et les ustensiles RNase libres. Traiter la verrerie avec inhibiteur de RNase (RNaseZAP, Ambion) suivie d'un rinçage à l'eau traitée au DEPC. Assurez-vous que tous les réactifs sont confirmés comme RNase. 1. Préparer mRNP Lysate Cultiver et récolter les cellules des tissus en croissance exponentielle pour produire entre 2-5 mg de protéines totales pour chaque RIP. Deux P150 boîtes de culture sont généralement suffisants. Pour chaque RBP objet d'une enquête, le total des quantités cellulaires numériques et les protéines doivent être optimisées afin de maximiser l'ARNm cible appropriée et les interactions pratiques commerciales restrictives. RIP pour qRT-PCR peut exiger lysat cellulaire moins (environ 400 ug de protéine totale) grâce à son amplification et la méthode de détection en particulier pour les pratiques commerciales restrictives abondance élevés tels que HuR, AUF1, TIAR. </Li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 8-10 min à 4 ° C, puis laver trois fois avec PBS glacé. Après lavage final, tapotez doucement la partie inférieure du tube et resuspendre le culot cellulaire dans des volumes égaux de tampon de lyse préparée polysome (PLB) avec les inhibiteurs de la protéase et la RNase. Il est recommandé de mesurer le volume exact de culot cellulaire. Mélange pipette doucement (ne pas vortexer) pour briser les amas de cellules et incuber lysat sur glace pendant 5 min. Centrifugeuse à 13.000 xg pendant 20 min à 4 ° C pour effacer le lysat de débris. Transférer immédiatement effacé surnageant dans le tube de centrifugeuse pré-réfrigérés. Garder sur la glace et conserver à -80 ° C. Congélation immédiate complète la lyse des cellules correcte et empêche la liaison indésirable. Passez par le dégel RIP échantillon immédiatement suivant et conserver les échantillons sur la glace pour éviter la dégradation des ARN. </Li> Ce lysat peut être stocké pendant jusqu'à six mois à -80 ° C. Eviter de multiplier les cycles de congélation-décongélation, car cela peut conduire à des protéines et / ou la dégradation de l'ARNm. Quantifier la concentration de protéines dans le lysat en utilisant un dosage standard de protéines Bradford. 2. Protéine d'enveloppe A billes de sépharose avec des anticorps et Wash Pré-houle protéine A-Sepharose (PAS) des perles pendant la nuit dans NT2 tampon (volumes 3-4) avec 5% de SAB. Stocker à 4 ° C. Le stockage à long terme de plusieurs mois à 4 ° C est possible lorsque complété avec de l'azide de sodium à 0,1%. Billes de Sepharose protéines doit être choisie en fonction de l'isotype de l'anticorps RBP cible. Un protéines G, et A / G ont toutes des cibles spécifiques d'isotype et de modification de l'affinité cible. Un protéines perles de sépharose ont été utilisés en fonction de la spécificité et de l'affinité isotype des anticorps anti-protéines HuR. Avant toute utilisation, enlever l'excès de tampon NT2, de sorteque les perles finales au rapport du tampon est de 1:1. En utilisant des tubes de 1,5 ml microtubes RNase, retirez PAS 100 pl de suspension et ajouter 30 pg d'anticorps pour chaque réaction IP individuelle (c.-à-spécifique RBP et contrôle isotypique). Ajouter 100-200 ul de tampon NT2 à l'anticorps talon mix. Mélange peut être conservé pendant plusieurs semaines à 4 ° C quand il est complété avec de l'azide de sodium à 0,1%. Un anticorps d'isotype apparié ou toute sérums normaux de même espèce doit être utilisé en parallèle comme un contrôle de l'anticorps contre l'ARN de fond. Ajouter anticorps approprié mélange de billes et incuber pendant la nuit, tumbling fin sur l'extrémité à 4 ° C. Optimiser le titre d'anticorps de la protéine spécifique à l'étude (pg 1, 5, 10 ou 30 de l'anticorps est généralement suffisant). Préparer anticorps billes revêtues immédiatement avant l'utilisation d'un lavage avec 1 ml deglacée NT2 tampon de 5 fois. Laver mélange de billes par centrifugation à 13.000 xg pendant 1-2 min à 4 ° C. Retirez délicatement le maximum de surnageant avec pipette à la main ou un aspirateur mais attention à ne pas perturber le culot. Lavage aide à éliminer les anticorps non liés ainsi que les contaminants RNase partir d'un mélange d'anticorps. Une fois que le dernier lavage est terminé, remettre en suspension les billes dans 700 ul d'glacé NT2 tampon suivi d'un traitement avec des inhibiteurs de RNase différents pour protéger les ARNm cibles, y compris 10 pl de RNase Rupture à 40 U / ul, 10 ul de 100 mM TNT et 15 ul d'EDTA (15 mM). Amener le volume à 1000 pi avec NT2 tampon. Complexes de vanadyle ribonucléoside ne sont pas utilisés en raison de l'effet inhibiteur de l'EDTA. 3. Immunoprécipitation et de l'ARN Précipitations Étape facultative Préclair: Pour réduire le fond, des perles et des anticorps de contrôle peut être utilisé pour pré-clair lysat. Cela peut réduire de signal à la sortie. Cette étape peut être nécessaire de réduire le fond lorsque vous faites IP suivie par microarray. Il n'est généralement pas nécessaire pour IP suivie par qRT-PCR. Préclair avec 15 pg de contrôle isotypique pour 30 min / 4 ° C fin tombant sur la fin. Ajouter 50 ul de billes PAS pré-gonflée non enrobées avec l'anticorps de l'étape 2.1. Incuber 30 min / 4 ° C avec rotation sur l'extrémité fin Centrifuger à 10000 xg à 4 ° C. Conserver le surnageant pour la propriété intellectuelle. Ajouter 100 ul de lysat clarifié isolé (environ 2-5 mg) de mélange d'anticorps préparée. Dilution lysat aidera à réduire le fond et la liaison non spécifique. Montant de la contribution lysat peut varier en fonction de la méthode de détection et l'abondance des RBP ol'efficacité de l'anticorps r RBP comme indiqué dans 1.1.C. étape (Optionnel) Mélanger immédiatement tube en effleurant doucement plusieurs fois suivi par une brève centrifugation à 10.000 xg à 4 ° C à billes de granulés et de retirer immédiatement 100 pl de surnageant comme une représentation ARNm total des intrants pour l'analyse qPCR en utilisant des techniques d'isolement d'ARN. Cette étape consiste à confirmer que l'entrée lysat ARN est optimale pour la propriété intellectuelle et ne doivent être effectuées que d'une étape de contrôle ou comme une étape de dépannage suivant RIP avec des résultats ARN pauvres. Envelopper dans un tube de parafilm afin d'assurer une fermeture hermétique et laisser incuber à 4 ° C pendant 2 à 4 heures, tumbling fin sur l'extrémité. Timing sur incubation doit être optimisée en fonction de l'abondance cible et doit être minimisée pour éviter réarrangement complexe ou de dégradation. Pour certaines pratiques commerciales restrictives courtes incubations peuvent être plus optimale. Perles pellets à 5.000 XGFou 5 min à 4 ° C et conserver le surnageant pour l'analyse par Western blot potentiel. Boutique aliquotes à -80 ° C. Des aliquotes de surnageant avec de grandes quantités de protéine cible résiduel peut indiquer une défaillance de la protéine à être précipité par billes de sépharose. Comme décrit précédemment, laver perles 5 fois avec 1 ml de tampon glacé NT2 et centrifugation (5000 xg pendant 5 min à 4 ° C), puis enlever le surnageant avec pipette à la main ou un aspirateur. Méthodes de lavage plus rigoureuses peuvent être utilisés pour réduire le fond en le complétant NT2 tampon avec le désoxycholate de sodium, l'urée ou le SDS. Conserver les échantillons sur la glace autant que possible et de travailler rapidement pour minimiser la dégradation de l'ARNm cible. En option: Enregistrer une petite aliquote (10%) du mélange de billes ou d'exécuter un échantillon supplémentaire en parallèle pour vérifier l'efficacité de la protéine cible IP en utilisant une analyse par Western blot. 4. DNase et la protéinase K Traitements Après le lavage, les billes remettre les avec 100 ul de tampon NT2 supplémenté avec 5 ul de RNase-free DNase 1 (2 U / pl). Conserver à 37 ° C pendant 5-10 min. Ajouter 1 ml de tampon NT2 et centrifuger à 5000 xg pendant 1 min à température ambiante. Un petit (~ 10%) aliquote de billes peuvent être utilisés pour vérifier l'efficacité IP par analyse SDS-PAGE. Resuspendre PAS concentré dans 100 ul de tampon NT2, 5 pi protéinase K (10 mg / ml), et 1 pi SDS à 10%. Incuber le mélange remis en suspension de billes pendant 30 min à 55 ° C dans un bain d'eau, doucement effleurant à toutes les 10 min. Protéinase K facilitera la libération des composants RNP. Perles granulés dans 5000 xg pendant 5 min à température ambiante (RT) et recueillir le surnageant (~ 100 pi). Ajouter 200 ul de tampon NT2 à billes, centrifuge 5000 xg pendant 2 min à température ambiante, ramasser le surnageant (~ 200 pi), et des perles de rejet. Combinez surnageants (100 pi et 200 pi) et ajouter 300 ul couche inférieure de l'acide phénol-CHCl 3. Vortex, 1 min RT (ou 37 ° C dans un shaker) et centrifuger à 16000 xg à température ambiante pendant 1 min. Recueillir 250 ul de la couche supérieure (NE PAS perturber l'interface), ajouter 25 ul d'acétate de sodium à pH 5,2, 625 ul EtOH à 100% et 5 glycoblue pi, et bien mélanger. Rangez la nuit à -20 ° C. Pour assurer une récupération correcte de l'ARN, l'addition de glycoblue va augmenter la visibilité de la culot d'ARN, en agissant comme une molécule porteuse. Le lendemain, les tubes de mélange par inversion 3-5 fois, tournent à 12.000 xg à 4 ° C pendant 30 min et éliminer le surnageant. Ajouter 1 ml de EtOH à 70% à la pastille bleue et mélanger par inversion ou vortex. Centrifuger 12.000 xg à 4 ° C pendant 2 min. Discard surnageant et centrifuger 12.000 xg pendant 1 min à 4 ° C. Retirez tout ETOH résiduelle de 70% avec une pipette et l'air sec de bouletage à TA pendant 5 min. Remettre en suspension dans ul 20-40 du RNase / DNase eau ou un autre volume approprié selon les besoins. L'échantillon est maintenant prêt pour d'autres applications en aval tels que qRT-PCR ou puces à ADN. Spectrophotométrie Nanodrop peut être utilisée pour évaluer la concentration d'échantillon, mais de précieux échantillons, il peut être avantageux d'éviter échantillons nanodropping car il peut être inutile et relativement imprécis. Nous vous proposons des échantillons de normalisation à transcrits du gène d'entretien ménager pour évaluer la pureté et l'efficacité IP pour les échantillons précieux de rendement ou faible. 5. Les résultats représentatifs Si la procédure est optimisé et réalisé correctement, l'immunoprécipitation devrait donner enrichissement significatif des ARNm cibles. Typiquement, En fonction de la RBP et son ARNm cible (s), nous voyons enrichissement d'environ 10 – à 50 fois lorsqu'elle est évaluée par qRT-PCR. De nombreux objectifs de pratiques commerciales restrictives peuvent être découverts en masse en utilisant l'analyse des microréseaux. Cependant, cette méthode est plus sensible à la dégradation par rapport à qRT-PCR. En fonction de la RBP, le nombre de cibles et de l'efficacité de la réaction, puces à ADN peuvent révéler des centaines de nouvelles cibles, ou il ne peut découvrir quelques-uns, le cas échéant. Par exemple, l'un des mieux caractérisés ARN protéines HuR obligatoire, post-transcriptionnel régule l'expression et la traduction de nombreux gènes importants physiologiques 1, 2. L'isolement du HuR-ribonucleo complexe via le protocole RIP-Chip dans les lignes cellulaires du cancer du sein, par exemple, a révélé l'enrichissement de plusieurs objectifs importants Hur connus, y compris β-actine en utilisant qRT-PCR comme le montre la figure 1. Dans les deux lignées de cellules cancéreuses β-actine est enrichie 12 – à 15 fois. En règle générale, lorsqu'il est effectué correctement, nous voyons une importante enrichment de β-actine dans différentes lignées cellulaires. Toutefois, si le RIP ne révèle aucun enrichissement significatif pour β-actine cela indique un problème avec le RIP et la procédure peut être répétée. Par ailleurs, l'analyse des microréseaux d'échantillons immunoprécipités provenant de ces lignées cellulaires ont révélé des sous-ensembles distincts d'expression de cibles Hur en récepteurs aux œstrogènes différents (ER) de cellules positives MCF-7 de cancer par rapport aux ER négatives lignes du sein MB-231 de cellules cancéreuses comme le montre la figure 2 1. Ces objectifs se répartissent en plusieurs catégories: les objectifs Hur connus et inconnus qui étaient soit associés ou non associés au cancer. Par exemple, CALM2 et CD9 sont à la fois les gènes du cancer qui n'ont pas été précédemment identifiées comme cibles Hur. Utilisation de la puce à ADN et en confirmant avec qRT-PCR, CALM2 et CD9 sont révélés être de 5 – à 180 fois enrichi dans le culot HuR indiquant une interaction importante entre la protéine et HuR ces gènes cibles. <img src = "/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg" alt = "Figure 1" /> Figure 1. Immunoprécipitation et RIP MB-231 (ER-) et MCF-7 (ER +) des cellules cancéreuses du sein. Immunoprécipitations ont été réalisées à partir de MB-231 ou MCF-7 lysats cellulaires en utilisant anti-HuR anticorps monoclonal (3A2) et IgG1 isotype contrôle. IP A. ouest de HuR révélé bande de taille attendue détectée par 3A2. Groupe d'experts sur le droit révèle quantités de HuR en entrée lysats occasion à partir de deux lignées cellulaires, avec β-tubuline comme un contrôle du chargement. B. Vérification par RT-PCR quantitative a montré quinze et onze fois enrichissements de β-actine, une cible HuR connu, dans les PI 3A2 du MB-231 et MCF-7, respectivement. Toutes les valeurs ont été normalisées à ΔΔCT GAPDH. Des expériences ont été faites en double exemplaire (n = 2). Figure 2. HuR RIP-CHIP identifie différents profils génétiques dans ER + et les cellules cancéreuses du sein ER-.Immunoprécipitations ont été réalisées à partir de Hur MB-231 ou MCF-7 lysats cellulaires en utilisant un anticorps IgG1 et HuR contrôle isotypique hybridé à Illumina tableaux Sentrix (47.000 gènes). Les signaux de commande ont été soustraites. Les résultats représentent les données cumulatives de 12 tableaux différents. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3) pour chaque lignée cellulaire avec des contrôles correspondants. Les échelles sont log2.