Паразита индуцированные генетически Руководствуясь аутоиммунные болезни Шагаса сердца в куриный модели

1. Рост паразитов Рост trypomastigote форм Т. cruzi Береника и β-галактозидазы, выразив Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 в мышиные клетки мышцы (L6) выращивают в Дульбекко минимальный основной среде с 10% FSB, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 250 нМ L-глутамин (рН 7,2), 5% CO 2 при 37 ° C. Свободное плавание trypomastigotes в надосадочной среды были использованы для заражения куриных яиц. Рост Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 акции выросли в DMEM с 20% ЭТС. Форма Lb промастиготы в экспоненциальной фазе роста использовали для инокуляции яиц 9. 2. Прививка паразитов в оплодотворенных куриных яиц Инокулировать подвески 100 т. cruzi trypomastigotes в 10 мкл культуральной среды через 2-мм отверстие в оболочке яйца на верхней воздушной камеры стадииX оплодотворенные яйца. Вторжения и репликации опасных паразитов в клетках эмбриона показано в видео S1. Контрольной группы являются следующие: а) контроль кур, б) макет яйца контроль получения 10 мкл культуральной среде, в) этап X оплодотворенные яйца привитых с подвеской 100 promastigotes Lb в 10 мкл культуральной среды Т.. cruzi и Lb принадлежат kinetoplastid семьи. Соответственно, эти простейшие расти свободно в цитоплазме или в паразитофорной вакуоли клеток хозяина 10. Уплотнение отверстия липкой лентой. Инкубируйте T. cruzi-инфицированные яйца и макет и неинфицированных контрольных проб в 37,5 ° C и 65% влажности в течение 21 дней. Держите цыплят, которые вылупляются в инкубаторе в течение 24 ч, а затем при 32 ° C в течение трех недель. 3. Получение образцов для выделения ДНК Мононуклеаров периферической крови клетки были получены от кур: а)вылупившиеся из T. cruzi привиты яйца, б) контроля, в) получение издевается 10 мкл культуральной среды, г) вылупился из яйца Lb привиты, белые кровяные клетки с курами, обрабатываются для экстракции ДНК в соответствии со стандартным протоколом 11. Извлечение ДНК из спермы также собраны из петухов, и от бесплодных ооцитов (<5 мм), собранных от кур, вылупившихся из яиц привитых с Т. cruzi, и кур, вылупившихся из яиц контроль 3, 4. Извлечение kDNA от Т. cruzi эпимастигота формы и, кроме того, из Lb promastigotes, как описано в другом месте 9. 4. Праймеры и зонды использовано Праймеров для амплификации ПЦР и тепловые условия приведены в таблице 1. Зонды, используемые в Южной гибридизации пятном были: Дикого типа minicircle (~ 1,4 кб) последовательностей пуриFied от Т. cruzi эпимастигота форм; Minicircle фрагментов (362 б.п.), полученный НСИ я дайджесты дикого kDNA; Ядерная ДНК (nDNA) повторяющиеся последовательности (188 б.п.), полученный усиления паразита ДНК с Tcz1 / 2 праймеров. Зонды были очищены от 1% агарозном геле 3. Дикого типа minicircle (~ 0,820 кб) последовательностей из Lb promastigotes. 5. ПЦР-анализ Выполните стандартную процедуру ПЦР с геномной ДНК от инфицированных цыплят и неинфицированных управления и издеваться над использованием T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 и kDNA s35/s36 13 праймеров. Кроме того, работать ПЦР с геномной ДНК от кур вылупившихся из Lb-инфицированные яйца помощью простейших конкретных Lb3 и Lb5 праймеров (табл. 1). Сделать реакционной смеси с 100 нг ДНК-матрицы, 0,4 мкМ каждой пары праймеров, 2 U Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мМ дНТФ и 1,5 мМ MgCl <sиь> 2 в 25 мкл конечного объема. Установите программу для Термоциклер 95 ° C в течение 5 мин, 30 циклов 30 секунд при 95 ° C/30 сек при 68 ° С / 1 мин при 72 ° С, 5 мин окончательное расширение до охлаждения. Анализ продуктов амплификации в 1,3% агарозном геле, который передается на положительно заряженных нейлоновую мембрану (GE Life Sciences) в щелочной метод гибридизации с зондами помечены [α-32 P] дАТФ использованием случайного праймера маркировки Kit (Invitrogen , Карлсбад, Калифорния). 6. Геномная Южной Блоты Используйте Мбо я и / или Eco RI (Invitrogen) ферменты, которые делают одно сокращение minicircles интегрирована в ДНК образцов тканей тела. Дайджест ДНК из неинфицированных кур контроля, а также куры вылупился из яйца привитых с опасной T. cruzi формы. Тема дайджесты ДНК T. cruzi ииз образцов куриного тест для электрофореза в 0,8% агарозном геле при 50 В течение ночи при 4 ° C. Передача разделенных групп ДНК положительно заряженными нейлоновую мембрану. Гибридизации ДНК полосы с надписью радио kDNA зонда. Вымойте мембраны дважды в течение 15 мин при 65 ° C с 2X SSC и 0,1% SDS, дважды в течение 15 мин при 65 ° С каждой 0,2 x SSC и 0,1% SDS и авторадиограмма для различных периодов времени. 7. Целевые премьер-ХВОСТ-PCR Получить усиления kDNA minicircle интегрироваться в геном куриного модифицированным Хвост-PCR метод, который сочетает в себе kDNA грунтовки с конкретными грунтовка устанавливает 2 в трех ходить в циклах ПЦР, как показано на рисунке 1. Первичный цикл: каждая реакция включает в себя 200 нг ДНК-матрицы, 2,5 мМ MgCl 2 и 0,4 мкМ kDNA праймеров (S34 или S67), 0,2 дНТФ мм, 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Карловы Вары, CА). Используйте kDNA грунтовки в сочетании с 0,04 мкМ гг праймеров (gg1 в Gg6, таблица 1), отдельно. Установите температуру с 57,9 до 60,1 ° С в течение kDNA грунтовки и с 59,9 до 65,6 ° C для CR-1 грунтовки. Обратите внимание, что эти температуры выше, чем у (~ 45 ° C), необходимых для произвольного вырожденного праймеры, используемые в хвост-PCR 10. Использование температуры и циклы (MyCycle Термоциклер, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), описанной в предыдущей статье 3. Вторичный цикл: Развести продуктов ПЦР с основной цикл 1:40 (об / об) в воде. kDNA грунтовки S35 и S35 антисмысловых заменили предыдущие, вместе с теми же праймерами гг. Третичного цикла: развести PCR продуктов из вторичного цикла 1:10 (объем / объем) в воде и объединить гг грунтовки с S67 или S36 антисмысловых отдельно. Клонирование ПЦР третичного цикла продукции: Clone непосредственно в pGEM T легко вектор (Promega, Madison, WI)продукции, что последнее усиление гибридизации с kDNA зонда. Выберите клонов путем гибридизации с зондом kDNA и последовательности. Проверка tpTAIL-ПЦР в смеси 300 мкг kDNA от Т. cruzi с 200 нг ДНК от контроля птиц никогда не подвергается kDNA. Температуры и усиление циклов такие же используются для ДНК-теста птиц. 8. Болезнь Шагаса клинических проявлений Мониторинг роста и развития цыплят вылупились из T. cruzi инфицированные яйца и здоровых вылупившихся из незараженных яиц в день смертность и еженедельно для проявлений болезни. Обнаружение клинических отклонений в этих кур (рис. 2) и сделать электрокардиограф (ЭКГ) записи для оценки электрической оси, ЧСС и аритмии 3. Тема kDNA-мутировал и контролирует кур ежемесячно ЭКГ расширенной желудочка ООНipolar приводит AVF (левая нога), AVL (левая рука) и AVR (правая рука), и оценить отклонение средней электрической оси влево, что наводит на мысль о расширении сердца 3. 9. Патология и иммунохимических анализов Сердце записи и индексы массы тела после смерти природных kDNA мутировал кур (рис. 3). Получить индексы также для управления кур одного и того же возраста и пола. Возьмите разделы из сердца, пищевода, кишечника, скелетных мышцах, легких, печени и почек. Исправить ткани в буферном 10% формалина (рН 7,4), вставлять в парафин и сократить до 4 мкм разделы гематоксилин-эозином (HE) окрашивания и гистологического анализа (рис. 3). Урожай и делить пополам тканей эмбрионов вылупился из яйца паразитов, привиты с выражением β-галактозидазы, и в соответствии с X-Гал-пятно 9. Закрепите вторую половину ткани эмбриона в 10% формалине, рН 7,4 и действовать, как в шаге 9.3. Вырезать 4μm тонкий парафин ткани раздел и установить на стекло для микроскопического исследования. Инкубируйте разделы, отображающая X-Gal окрашенных синей клетки человека chagasic антисыворотки (1:1024 разбавления) против анти-Т cruzi антигена. Вымойте разделы мигом с PBS, 7,4 рН, 5 мин. Пятно синий клеток в эмбрион тканей второй инкубации с флуоресцеин-сопряженных кроличьих анти-IgG человека. Вымойте участки с PBS (шаг 8), крепление с покровным и наблюдать синий свет клетки-зеленым на рассмотрение в УФ-свете при 502 нм, 200х увеличение, для colocalizing T. cruzi в зачаточном состоянии клеток. 10. Фенотип клетки иммунной системы, в сердце поражения Фенотип клетки иммунной системы эффекторов в срезах ткани сердца от kDNA-положительных и от контроля kDNA-отрицательные кур. Поместите слайды ссрез ткани в парафин при температуре 65 ° С в течение 30 мин, чтобы расплавить воск до представления в четырех моет в 100% до 70% ксилола, а затем в абсолютном этаноле PBS в течение 5 минут каждый. Промойте слайдов в дистиллированную воду, воздух сухой, и обращаться с конкретными моноклональных антител (флуоресцеин или R-фикоэритрин конъюгированных моноклональных антител), полученные из SouthernBiotech, Бирмингем, Алабама. Используйте мышь, анти-курица-Бу-1 (Bu-1 и Ви-1 аллелей б, г-н 70-75 кДа) Маб AV20 признать мономорфных детерминант на антигенов клетки инбредных кур. Используйте мышь, анти-CD45 курица, Ig изотипа IgM1 κ относящиеся к куриным тимуса линии клеток (г-н от 190 до 215 кДа вариант). Используйте мышь, анти-курица TCRγδ + (Г-н 90-кДа гетеродимер) Маб, специфичные для тимус зависимых CD8α + Т-клеток. Используйте мышь, анти-курица Маб CD-8, специфичные для куриных α цепь (г-н 34 кДа) признать йэлектронной CD8 клеток в тимоцитов, селезенки, сердца и других тканей. Используйте мышь, анти-курица KuL01 исключительно признать, моноциты / макрофаги фагоцитарной системы. Вымойте слайд три раза с 0,1 М PBS, рН 7,4, 5 мин после инкубации с конкретными анти-фенотип антител в течение 90 мин во влажной камере. Соберите слайд с буфером глицерин для экзамена по флуоресцентным микроскопом с испусканием фильтр с длиной волны 567 и 502 нм, соответственно, для обнаружения красного и зеленого флуоресцентного меченых клеток (рис. 4). 11. Анализ данных Использование базы данных куриного генома ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) для анализа BLASTN последовательности. Используйте CLUSTALW выравнивания для определения электронной значения баллов. Применять Г.И.RI повторить алгоритм маскировки цензура ( http://girinst.org/censor/index.php ) для локализации различных классов повторяется в химерных последовательностей. Применять Kinetoplastid вставки и удаления последовательности Search Tool (KISS) для выявления потенциальных gRNAs в последовательности kDNA, с помощью WU-BLASTN модифицированных-матрицей 3. Использование Т. cruzi последовательности http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas искать в gRNAs в kDNA хозяина химеры ДНК. 11.6) Использование Стьюдента и Kolmorov-Смирнова испытания, соответственно, для выявления существенных различий между отклонений электрической оси, а также между сердцем / тело показатели веса, полученные в экспериментальной и контрольной групп, а также для выявления смертности соотношения значимых различий между группами цыплят вылупились от Т. cruzi яnoculated яйца и от контроля. 12. Представитель Результаты Прививка 100 опасных Т. cruzi trypomastigotes в воздухе камеры оплодотворенные яйца куриные не значительно сократить отношения цыплят живьем. Около 60% здоровых цыплят люк и 40% могут подвергаться сжижению эмбриона или зародыша смерти вылупления. Оставшиеся в живых цыплят сохранить последовательность kDNA minicircle интегрироваться в геном. Тем не менее, ожидается, что некоторые птенцы погибнут с кардиомегалия и неудачи в течение нескольких недель после вылупления. Остальные цыплят возрастет до внешне здоровых взрослых людей. На всех этапах жизни ДНК, выделенной из крови мононуклеаров даст ПЦР-амплификации kDNA, но не nDNA. Целевых премьер-ХВОСТ-PCR 3, 4 продуктов, которые клонируются и последовательность покажет kDNA minicircles интегрированы в основном в регионах кодирования macrochromosomes 1 до 5. Куры отображения нескольких kDNA яntegrations в генах, кодирующих роста и дифференцировки клеток, иммунных факторов системы регуляции и репарации ДНК являются кандидатами для прохождения отказ от самостоятельного тканях (рис. 3). Например, курица показывает kDNA мутации с разрывом в гене дистрофина (рис. 5), кодирующих белок, который связывает цитоскелета к клеточной мембране, является кандидатом на развитие аутоиммунных воспалительных кардиомиопатии и неудачи. Эти модификации генома не видел цыплят из Lb инфицированных яиц. Существуют различия между T. cruzi и Lb kDNA minicircles, Т. cruzi к ДНК minicircle среднем 1,4 кб структуру с четырьмя переменными области (VR) перемежаются консервативных регионов (CR), каждый представляет CSB1, CSB2 и CSB3 регионов, в которых CA-богатые ДНК изогнутые рассматриваются конкретные сайты для инициации репликации, транскрипции, рекомбинации, так и для горизонтальной передачи ДНК <sдо 3> 4. Контрастно, Lb kDNA minicircle (средний размер 820 б.п.) содержит одну CR следует VR. CR сохранил CSB1 (GGGCGT) и CSB2 (CCCCGTTC) блоки, которые отличаются от тех, в Т. cruzi minicircles 15, 16 и 17. Учитывая, что Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) показывает 12 НТС гомологии T. cruzi можно предположить, что либо Lb kDNA minicircle интегрируется в более низких частот, которые могут быть не видны на методы, используемые, или что он может, вероятно, не интегрируются в геном курицы вообще. Грунтовка ДНК-мишени Последовательность Т * S 34 Т. cruzi kDNA 5 'ACA ОСО ACC ОСО УВД ГАА CC 3' 57,9 S 67 Т.cruzi kDNA 5 'ГГТ ТТТ GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3 " 60,1 S 35 Т. cruzi kDNA 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4 S 36 Т. cruzi kDNA 5 'ГГТ TCG АТТ ГТТ ГГТ GGG G 3 " 57,9 Lb3 Lb kDNA 5 'GGG GTT ГГТ GTA ATA TAG TGG G 3 " 55,9 Lb5 Lb kDNA 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3 " 61,4 GG 1 Gallus Gallus 5 'AGC TGA TCC ТАА CAG AGG AGC 3' 60,1 GG2 Г. Gallus 5 'КТГ AGC СТС ТГКТТТ ГАА 3 ' 56,8 Gg3 Г. Gallus 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 " 60,1 GG4 Г. Gallus 3 'GCT КТГ CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64,2 Gg5 Г. Gallus 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62,3 Gg6 Г. Gallus 3 'КТГ TTA GCA TGA GGC TTC ACA 5' 60,4 Таблица 1. Простые, используемые в ПЦР уточнениями. * Т = средняя температура отжига ° C. Рисунок 1. Р Хвост-PCR стратегия используется для обнаружения Trypanosoma cruzi kDNA интеграции в Gallus Gallus генома. А) химерных последовательностей с фрагментом kDNA minicircle консервативных (синий) и переменной (голубой) регионов интегрирована в очаге NW_001471687.1 в хромосоме 4 (AY237306) из куриного генома 10 (зеленый) был использован для получения принимающей конкретного набора праймеров (gg1 в Gg6). Б) р Хвост-PCR амплификации были начаты (первичный цикл) по отжигу minicircle конкретных S34 или S67 грунтовки в сочетании с куриным конкретных gg1 в Gg6 праймеров. Разводненная продуктов, предоставляемых шаблон для вторичного цикла с S35 (смысл / антисмысловые) грунтовки и комбинации праймеров гг. В третичном цикле разведения вторичные продукты подвергали амплификации kDNA S36 или S67 грунтовки антисмысловых в сочетании с грунтовкой Ггс. C) Эти продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле и переданы в нейлоновой оболочкой, гибридизации с зондом конкретных kDNA. Образцы показывает позитивный сигнал были использованы для клонирования, чтобы определить точку интеграции. Комбинации kDNA и целевых gg1 в Gg6 показаны в верхней части геля. Последовательных реакций ПЦР усиления целевой kDNA хозяина ДНК с kDNA minicircles (синий) и птичий последовательность (зеленый). (Перепечатано из PLoS забытых тропических болезней 3). Рисунок 2. Клинические проявления нарушения функции сердца в 9-месячный цыпленок генетически модифицированные интеграции митохондриальной kDNA minicircle от Т. cruzi. Бедная кислородом кровь митохондриальной kDNA мутировал курица показывает фиолетовый контрастов гребень с ярко-красными гребень управление 9-месячного chickeя свободна от повреждения сердца. (По материалам PLoS забытых тропических болезней 3). Рисунок 3. Гросса и микроскопических патологии Gallus Gallus с мутациями kDNA. А) Кардиомегалия в 9-месячный курицу, которая умерла от сердечной недостаточности. Б) Управление сердце от неинфицированных 9-месячного курицы. C) Отказ от клетки-мишени сердца цитотоксических лимфоцитов: минимальная единица отказ с лизиса клеток-мишеней иммунной лимфоцитов изображен (круг). D) Управление сердце гистологии (с изменениями по PLoS забытых тропических болезней 3). Рисунок 4. Иммуноцитохимическая анализ клетки иммунной системы проникают в сердце kDNA-мутировал курица показано на рисунке 3. А) CD45 + лимфоцитов определены (стрелки) в сердце леsions по фикоэритрин-меченных моноклональных антител. B) CD8 + γδ иммунных лимфоцитов (стрелки), участвующих в серьезные разрушения сердца. С), обильные CD8α + Т-клеток, присутствующих в тяжелые поражения сердца с лизирует клетки. Вставки показывают отсутствие клеток иммунной системы в борьбе неинфицированных сердце курицы (с изменениями по PLoS забытых тропических болезней 3). Рисунок 5. Шагаса, как расширенные воспалительных кардиомиопатии в F2 потомство с kDNA интеграции в гене дистрофина. А) Расширенные сердце в 10-месячный цыпленок занимает большую часть грудной полости (сердце вес = 16 г). Б) темный круглый мононуклеарных инфильтратов и разрушает клетки миокарда kDNA-мутировал курицы. C) Нормальный размер сердца (весом 7 г) на 10-месячный контроль курицы. D) Нормальный гистологии сердца куриного управления. (По материалам PLoS забытых Tropicдр. болезней 3). Рисунок 6. Сравнительная патология в kDNA-мутировал курицу и в человеческой болезни Шагаса. А) тяжелый миокардит и целевых лизирует клетки сердца в kDNA-мутировал курицы. Б) Тяжелый миокардит и лизиса клетки-мишени иммунной лимфоцитов в случае сердечно-сосудистых заболеваний Шагаса. C) Отказ от сердечных клеток иммунной лимфоцитов в kDNA-мутировал курицы. D) Отказ от сердечных клеток иммунной лимфоцитов человека болезнью Шагаса. Окраска по гематоксилином и эозином. (С изменениями по Memorias сделать Института Освальдо Круса, Рио-де-Жанейро, 14).