Parasite induite génétiquement Driven maladies auto-immunes coeur de Chagas dans le modèle de poulet

1. La croissance des parasites Cultiver formes trypomastigotes de T. cruzi Bérénice et la β-galactosidase exprimer Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 dans la cellule musculaire murin (L6) cultivé dans un milieu essentiel minimal de Dulbecco avec 10% du FSB, 100 UI / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, et 250 nM de L-glutamine (pH 7,2), 5% CO 2 à 37 ° C. Les trypomastigotes de libre-natation dans le milieu surnageant ont été utilisés pour inoculer des œufs de poule. Cultiver Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 stocks cultivées dans du DMEM avec 20% de FBS. La forme promastigote Lb dans la phase de croissance exponentielle a été utilisé pour inoculer les oeufs 9. 2. L'inoculation du parasite dans les œufs de poule fécondés Inoculer une suspension de 100 T. cruzi trypomastigotes dans 10 ul de milieu de culture à travers un trou de diamètre de 2 mm dans la coquille d'oeuf sur le dessus de la chambre à air de l'étapeX oeufs fertiles. L'invasion et la réplication des parasites virulents dans les cellules embryonnaires sont présentés dans S1 vidéo. Les groupes de contrôle sont comme suit: a) les poulets de contrôle; b) les œufs de contrôle des simulacres de réception 10 ul de milieu de culture; c) X scène des oeufs fertiles inoculés avec une suspension de 100 Lb promastigotes dans 10 ul de milieu de culture T.. cruzi et Lb appartiennent à la famille kinétoplastide. Respectivement, ces protozoaires se développer libre dans le cytoplasme ou dans la vacuole parasitophore de 10 cellules hôtes. Sceller les trous avec du ruban adhésif. Incuber le T. cruzi infectés par des oeufs et des échantillons de contrôle des simulacres et non infectés à 37,5 ° C et une humidité de 65% pendant 21 jours. Gardez les poussins qui éclosent dans l'incubateur pendant 24 h puis à 32 ° C pendant trois semaines. 3. L'obtention d'échantillons pour l'extraction d'ADN Cellules mononucléées du sang périphérique ont été obtenus à partir de poulets: a)éclos à partir de T. oeufs inoculés cruzi, b), c) les contrôles se moque recevant 10 ul de milieu de culture; d) sont issus d'œufs inoculés Lb; globules blancs de poulets sont traitées pour l'extraction de l'ADN selon un protocole standard 11. Extraire l'ADN aussi de sperme collecté à partir des coqs, et à partir d'ovocytes non fécondés (<5 mm) collectés auprès des poules issus d'œufs inoculés avec T. cruzi, et de poules issus d'œufs de contrôle 3, 4. Extrait ADNk de la T. cruzi épimastigote forme et, aussi, de promastigotes Lb, comme décrit par ailleurs 9. 4. Les amorces et les sondes utilisées Les amorces utilisées pour les amplifications PCR et les conditions thermiques sont indiquées dans le tableau 1. Les sondes utilisées dans des hybridations Southern blot étaient les suivants: De type sauvage minicercle (~ 1,4 kb) des séquences puriFied de T. cruzi formes épimastigotes; Minicercle fragments (362 pb) obtenus par Nsi I recueils de type sauvage ADNk; Nucléaire (ADNn) séquence répétitive (188 pb) obtenu par amplification de l'ADN du parasite avec les amorces Tcz1 / 2. Les sondes ont été purifiés à partir de 1% des gels d'agarose 3. De type sauvage minicercle (~ 0,820 kb) à partir de séquences promastigotes Lb. 5. Analyses PCR Exécutez la procédure standard de PCR avec des ADN génomiques de poussins infectés et non infectés et se moquer des contrôles à l'aide T. cruzi ADNn Tcz1 / 2 12 et ADNk s35/s36 13 amorces. En outre, exécutez PCR avec des ADN génomiques provenant de poulets issus d'Lb infecté des oeufs en utilisant les protozoaires spécifiques Lb3 et LB5 amorces (Tableau 1). Faire mélange réactionnel avec 100 ng ADN matrice, 0,4 M de chaque paire d'amorces, 2 polymérase Taq ADN U, 0,2 mM de dNTP, et 1,5 mM MgCl <sub> 2 dans un volume de 25 uL finale. Sélectionnez le programme thermocycleur à 95 ° C pendant 5 min, 30 cycles de 30 sec à 95 ° C/30 sec à 68 ° C / 1 min à 72 ° C avec extension de 5 min finale avant la réfrigération. Analyser les produits d'amplification de 1,3% sur gel d'agarose, qui est transféré à une membrane de nylon chargée positivement (GE Life Sciences) par la méthode alcaline pour l'hybridation avec des sondes spécifiques marquées avec [α-32 P] dATP en utilisant au hasard étiquetage Primer Kit (Invitrogen , Carlsbad, CA). 6. Génomiques Southern blots Utilisez Mbo I et / ou avec Eco RI (Invitrogen) enzymes qui font des coupes individuelles en minicercles intégrés dans des échantillons d'ADN des tissus du corps. ADN Digest de poulets témoins non infectés et de poulets issus d'œufs inoculés avec T. virulente cruzi forme. Sous réserve de la digestion de l'ADN de T. cruzi età partir d'échantillons de test de poulet à l'électrophorèse en gel d'agarose 0,8% à 50 V une nuit à 4 ° C. Transfert des bandes d'ADN séparés à la membrane de nylon chargée positivement. Hybrider les bandes d'ADN avec la radio sonde marquée ADNk. Lavez la membrane deux fois pendant 15 min à 65 ° C avec du SSC 2X et SDS 0,1%, deux fois pendant 15 min à 65 ° C chacune avec 0,2 X SSC et 0,1% de SDS, et autoradiographie pour des périodes de temps variables. 7. Premier ciblé QUEUE-PCR Obtenir l'amplification de la ADNk minicercle intégré dans le génome de poulet par une version modifiée QUEUE-technique de PCR, qui combine amorces ADNk avec amorce spécifique fixe au 2 dans trois de plain-pied dans les cycles de PCR nichée, comme le montre la figure 1. Cycle primaire: Chaque réaction comprend 200 ng d'ADN matrice, 2,5 mM MgCl 2, et 0,4 M de ADNk amorces (S34 ou S67), 0,2 mM de dNTPs, 2,5 U de Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Utilisez les amorces ADNk en combinaison avec 0,04 M de Gg amorces (gg1 à Gg6, tableau 1), séparément. Réglez la température de 57,9 à 60,1 ° C pour les amorces et ADNk 59,9 à 65,6 ° C pour le modèle CR-1 amorce. Notez que ces températures sont plus élevées que celles (~ 45 ° C) nécessaire pour les amorces dégénérées utilisées arbitraires dans les 10 QUEUE-PCR. Utilisez la température et des cycles (MyCycle Thermocycleur, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) décrites dans un précédent article 3. Cycle du secondaire: Diluer les produits de PCR de cycle primaire 1:40 (v / v) dans l'eau. ADNk amorces antisens S35 et S35 remplacé les précédents, avec les amorces Gg mêmes. Cycle de tertiaire: Diluer les produits de PCR à partir du cycle secondaire 1:10 (v / v) dans de l'eau et de combiner avec des amorces Gg S67 antisens ou S36, séparément. Cloner les produits de PCR de cycle supérieur: Clone directement dans pGEM T vecteur facile (Promega, Madison, WI)les produits d'amplification dernière qui s'hybrident avec la sonde ADNk. Sélectionnez clones par hybridation avec la sonde et la séquence ADNk. Valider le tpTAIL-PCR dans un mélange de 300 pg de ADNk de T. cruzi avec 200 ng de l'ADN des oiseaux de contrôle jamais exposé à ADNk. Les cycles de température et d'amplification sont les mêmes utilisés pour l'ADN des oiseaux d'essais. 8. Manifestation de Chagas Clinique des maladies Surveiller la croissance et le développement de poulets éclos à partir de T. cruzi infectés œufs et des contrôles sains issus d'œufs non infectés par le quotidien de la mortalité et hebdomadaire pour les manifestations de la maladie. Détecter des anomalies cliniques dans ces poulets (Figure 2) et de faire électrocardiographe (ECG) pour évaluer les axes électriques, les taux cardiaque et des arythmies 3. Sous réserve ADNk muté et contrôle de poulets par mois pour les enregistrements ECG de ventriculaire augmentée des Nations Uniesipolar conduit aVF (jambe gauche), AVL (bras gauche), et AVR (bras droit), et d'évaluer l'écart de l'axe électrique moyenne vers la gauche, ce qui suggère l'élargissement de 3 coeur. 9. Analyses Pathologie et immunochimique Coeur d'enregistrement et les indices de poids corporel après décès naturels de poulets ADNk mutées (Figure 3). Obtenir des indices aussi pour les poulets de contrôle du même âge et le sexe. Prenez des sections du coeur, l'oesophage, les intestins, le muscle squelettique, les poumons, le foie et les reins. Fixer le tissu dans un tampon formol à 10% (pH 7,4), intégrer dans de la paraffine et coupé à 4 um d'épaisseur pour les sections hématoxyline-éosine (HE) de coloration et des analyses histologiques (figure 3). Tissus de récolte et de bisect à partir d'embryons issus d'œufs inoculés avec des parasites exprimant β-galactosidase, et sous réserve de X-Gal-tache 9. Fixer l'autre moitié des tissus d'embryons en 10% de formol, un pH de 7,4 et procéder comme à l'étape 9.3. Couper 4μm section mince tissu inclus en paraffine et monter sur la lame de verre pour l'examen microscopique. Incuber sections montrant X-Gal-cellules colorées bleues avec l'homme chagasique antisérum (1:1024 dilution) contre anti-T. antigène cruzi. Laver les coupes trice avec du PBS, pH 7,4, 5 minutes chacun. Colorer les cellules bleues dans les tissus d'embryons par seconde incubation avec un lapin conjugué à la fluorescéine anti-IgG humaine. Laver les coupes avec du PBS (étape 8), mount avec la lamelle et observer les cellules bleu clair-vert à l'examen jusqu'à sous la lumière UV à 502 nm de longueur d'onde, 200x de grossissement, pour colocalisent T. cruzi dans les cellules embryonnaires. 10. Les cellules du système immunitaire dans le phénotype des lésions cardiaques Phénotype des cellules immunitaires effectrices dans des coupes de tissus du cœur de ADNk-positif et de contrôle ADNk-négatifs poulets. Placer les lames aveccoupe de tissu inclus en paraffine à 65 ° C pendant 30 min pour faire fondre la cire précédente à la présentation en quatre lavages dans 100% à 70% de xylène, puis dans l'éthanol absolu du PBS pendant 5 min à chaque fois. Rincer les lames dans de l'eau distillée, sécher à l'air, et traiter avec des anticorps monoclonaux spécifiques (la fluorescéine ou la R-phycoérythrine-conjugués anticorps monoclonaux) obtenus à partir de SouthernBiotech, Birmingham, AL. Utilisez la souris anti-poulet Bu-1 (Bu-1 a et BU-1 allèles b, M. 70-75 kDa) Mab AV20 de reconnaître déterminant monomorphe sur les antigènes des cellules B de poulets consanguines. Utilisez la souris anti-CD45 de poulet, Ig isotype IgM1 κ spécifique des cellules de poulet lignée du thymus (M. 190 à 215 kDa variante). Utilisez la souris anti-poulet TCRγδ + (90-kDa de M. hétérodimère) Mab spécifique à charge du thymus CD8a cellules + T. Utilisez la souris anti-poulet Mab CD-8 spécifiques au poulet α de la chaîne (M. 34 kDa) reconnaissent ee dans les cellules CD8 thymocytes, la rate, le cœur, et d'autres tissus. Utilisez la souris anti-poulet KuL01 à reconnaître exclusivement monocytes et des macrophages du système phagocytaire. Laver la lame à trois reprises avec 0,1 M PBS, pH 7,4, à 5 min de chaque incubation après avec spécifique anti-phénotype d'anticorps pendant 90 min dans une chambre humide. Monter la lame avec de la glycérine tamponnée pour examen au microscope en lumière fluorescente avec filtre d'émission de longueur d'onde 567 et 502 nm, respectivement, pour détecter les cellules rouges et vertes marquées par fluorescence (Figure 4). 11. Analyse des données Utilisez la base de données du génome de poulet ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) pour des analyses de séquences BLASTN. Utilisez alignements CLUSTALW pour déterminer la valeur e-scores. Employer l'IGAlgorithme de masquage RI répétition CENSOR ( http://girinst.org/censor/index.php ) pour la localisation des différentes classes de répétitions dans les séquences chimériques. Employer l'insertion kinétoplastide et outil de recherche Suppression de séquence (KISS) pour identifier les potentiels gRNAs dans les séquences ADNk, à l'aide de WU-blastn-modified-matrice 3. Utilisez T. séquences cruzi http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133-s1.fas à la recherche en gRNAs dans les chimères d'ADN ADNk-hôte. 11,6 élèves Utilisations) de t et les tests Kolmorov-Smirnov, respectivement, pour détecter des différences significatives entre les écarts des axes électriques et d'un index de poids cardiaque / corps obtenus dans les groupes expérimentaux et de contrôle, et de détecter les taux de mortalité des différences significatives entre les groupes de poulets éclos de T. cruzi inoculated oeufs et de contrôles. 12. Les résultats représentatifs L'inoculation de 100 virulente T. trypomastigotes cruzi dans la chambre à air des œufs de poules fertiles ne réduit pas de manière significative les ratios de poussins éclos en vie. Environ 60% éclore les poussins en bonne santé et 40% peuvent subir de liquéfaction embryon ou mort de l'embryon à l'éclosion. Les poussins survivants retenir la séquence minicercle ADNk intégré dans le génome. Toutefois, on s'attend à ce que certains poussins vont mourir avec cardiomégalie et d'insuffisance dans les semaines après l'éclosion. Les poussins restent passera à l'extérieur des adultes en bonne santé. A tous les stades de la vie de l'ADN extrait à partir de leurs cellules mononucléées du sang donnera amplification par PCR de ADNk, mais pas ADNn. Le Premier ciblée-QUEUE-PCR 3, 4 produits qui sont clonés et la séquence montrera le ADNk minicercles intégrés principalement dans les régions codantes de macrochromosomes 1 à 5. Les poulets montrant ADNk multiples integrations dans les gènes codant pour la croissance et la différenciation cellulaire, des facteurs de régulation immunitaire système, et de réparation d'ADN sont des candidats à subir le rejet de tissus cibles auto (figure 3). Par exemple, le poulet montrant une mutation ADNk avec rupture de la gène de la dystrophine (Figure 5), codant une protéine qui se lie au cytosquelette à la membrane cellulaire, est un candidat de développer une cardiomyopathie inflammatoire auto-immune et l'échec. Ces modifications génomiques ne sont pas considérés dans les poussins issus d'œufs Lb infectés. Il existe des différences entre les T. cruzi et Lb minicercles ADNk; Le T. cruzi k ADN minicercle moyenne de 1,4 kb avec quatre structures région variable (VR) entrecoupé par les régions conservées (CR) présentant chacun CSB1, les CSB2 et CSB3 régions, dans laquelle CA riche en ADN pliées sont considérés comme des sites spécifiques pour l'initiation de la réplication, la transcription, recombinaison, et pour le transfert d'ADN latérale <sjusqu'à> 3, 4. Par contraste, le Lb ADNk minicercle (taille moyenne 820 pb) contient seule CR suivi par VR. CR a conservé CSB1 (GGGCGT) et CSB2 (CCCCGTTC) blocs, qui sont différentes de celles dans le T. cruzi minicercles 15, 16 et 17. Considérant que Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) affiche 12 homologie nts à la T. cruzi, il est concevable que soit la Lb ADNk minicercle intègre dans une fréquence beaucoup plus faible, ce qui peut ne pas être visibles par les techniques utilisées, ou qu'il peut, éventuellement, ne pas intégrer dans le génome du poulet à tous. Apprêt L'ADN cible Séquence Tm * S 34 T. cruzi ADNk 5 'ACA ACC ACC ACC ATC GAA CC 3' 57,9 S 67 T.cruzi ADNk 5 'GGG GGT TTT AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' 60,1 S 35 T. cruzi ADNk 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4 S 36 T. cruzi ADNk 5 'GGT TCG ATT GGG GGT GTT G 3' 57,9 Lb3 Lb ADNk 5 'GGG GGT GTT GTA TGG ATA TAG G 3' 55,9 LB5 Lb ADNk 5 'CTA GTG ATT CAC GGG GAG G 3' 61,4 GG 1 Gallus gallus 5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG CAG 3' 60,1 GG2 Gallus G. 5 'CTG CAG TGC CCTTTT GAA A 3 ' 56,8 GG3 Gallus G. 5 'TTT CAA CAG AGA GGC TCG G 3' 60,1 GG4 Gallus G. 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64,2 Gg5 Gallus G. 3 'AGC AAC GCG TCA TCC CAC TT 5' 62,3 Gg6 Gallus G. 3 'CTG TTA GCA GGC TGA TTC ACA A 5' 60,4 Primes Tableau 1. Utilisé dans les amplifications PCR. * Tm = température moyenne de recuit ° C. Figure 1. Le tp QUEUE-PCR stratégie utilisée pour détecter Trypanosoma cruzi ADNk intégration dans le génome Gallus gallus. A) une séquence chimérique avec un fragment de ADNk minicercle conservées (bleu foncé) et variable (bleu clair) régions intégrées dans le locus sur le chromosome NW_001471687.1 4 (AY237306) du poulet 10 génome (vert) a été utilisée pour obtenir l'hôte jeux d'amorces spécifiques (GG1 à Gg6). B) Les tp QUEUE-PCR amplifications ont été lancés (cycle primaire) par recuit des S34 ou S67 minicercle amorces spécifiques en combinaison avec les gg1 à Gg6 poulet amorces spécifiques. Produits dilués modèle fourni pour le cycle secondaire avec le S35 (sens / antisens) amorces et les combinaisons d'amorces Gg. Dans le cycle tertiaire une dilution des produits secondaires a été soumis à une amplification avec ADNk S36 ou S67 amorces antisens, en combinaison avec l'amorce Ggs. C) Ces produits d'amplification ont été séparés dans 1% des gels d'agarose et transférés sur membrane de nylon, hybridées avec la sonde spécifique ADNk. Les échantillons montrant un signal positif a été utilisée pour le clonage de déterminer le point de l'intégration. Les combinaisons de ADNk et ciblées gg1 à Gg6 sont indiqués sur la surface du gel. Les réactions séquentielles PCR amplifiés séquences cibles d'ADN ADNk-hôtes avec ADNk minicercles (bleu) et la séquence aviaire (vert). (Reproduit de PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figure 2. Les manifestations cliniques de la fonction cardiaque altérée chez un poulet de 9 mois vieille génétiquement modifiée par l'intégration de la mitochondrial ADNk minicercle de T. cruzi. La mauvaise oxygénation du sang de la poule ADNk mitochondrial muté montrant un peigne contrastes violets avec le peigne rouge vif de la commande 9-month-old chicken exemptes de dommages cardiaques. (Mise à jour de PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figure 3. Pathologie macroscopique et microscopique de l'espèce Gallus gallus à des mutations ADNk. A) une cardiomégalie dans une poule de 9 mois, qui est mort d'insuffisance cardiaque. Coeur de contrôle B) à partir d'un non infectés 9-mois-vieille poule. C) Le rejet des cellules cardiaques cibles par les lymphocytes cytotoxiques: Une unité de rejet minimal avec lyse des cellules cibles par les lymphocytes immunitaires est représenté (cercle). D) Contrôle coeur histologie (modification de PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figure 4. Analyses immunocytochimiques des cellules du système immunitaire infiltrant le cœur de ADNk-muté de poulet à la figure 3. A) les lymphocytes CD45 + identifiées (flèches) dans le cœur letions par un anticorps monoclonal marqué à la phycoérythrine spécifique. B) CD8 + yô lymphocytes immuns (flèches) impliqués dans la destruction sévère du cœur. C) L'abondance CD8a + cellules T présents dans les lésions sévères avec lyse des cellules cardiaques. Les inserts montrent l'absence de cellules du système immunitaire dans le cœur de poulet témoin non infecté (modification de PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figure 5. La maladie de Chagas en forme de cardiomyopathie dilatée inflammatoire dans un descendance F2 avec l'intégration dans le ADNk gène de la dystrophine. A) dans un coeur dilaté poulet 10-month-old occupant la majeure partie de la cavité thoracique (poids du cœur = 16 g). B) foncé rondes mononucléées des infiltrats de cellules et détruit le myocarde de la poule ADNk muté. C) la taille du cœur normal (poids 7 g) d'un poulet de commande 10-month-old. D) l'histologie normale d'un cœur de poulet. (Mise à jour de PLoS Neglected TropicMaladies al 3). Figure 6. Comparative pathologie ADNk-muté de poulet et dans la maladie de Chagas humaine. A) une myocardite sévère et lyse des cellules cibles du cœur chez le poulet ADNk muté. B) une myocardite sévère et lyse des cellules cibles par les lymphocytes immunitaires dans un cas de maladie de Chagas coeur. C) Le rejet des cellules cardiaques par les lymphocytes immunitaires chez le poulet ADNk muté. D) Le rejet des cellules cardiaques par les lymphocytes immuns dans la maladie de Chagas humaine. Souillée par le hématoxiline et de l'éosine. (Mise à jour de Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).