Parasite Induced Genetisch Gedreven Auto Chagas hart-en vaatziekten in de Chicken Model

1. De groei van Parasieten Grow trypomastigote vormen van T. cruzi Berenice en β-galactosidase tot expressie Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 in muizen spiercellen (L6) gekweekt in Dulbecco minimaal essentieel medium met 10% FSB, 100 IU / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, en 250 nM L-glutamine (pH 7,2), 5% CO 2 bij 37 ° C. De vrijzwemmende trypomastigotes in het supernatant medium werd gebruikt om eieren te inoculeren. Grow Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 voorraad gekweekt in DMEM met 20% FBS. De Lb promastigote vorm in de exponentiële groeifase werd eieren 9 inoculeren. 2. Parasite Inenting in bevruchte kippeneieren Inoculeer een schorsing van 100 T. cruzi trypomastigotes in 10 ul kweekmedium door een 2 mm diameter gaten in de eischaal boven de luchtkamer van faseX vruchtbare eieren. De invasie en de replicatie van de virulente parasieten in de cellen van embryo's worden weergegeven in de Video-S1. De controlegroepen zijn: a) controle kippen, b) mock controle eieren die 10 pl kweekmedium c) fase X bevruchte eieren geënt met een suspensie van 100 Lb promastigoten in 10 ul kweekmedium T.. cruzi en Lb behoren tot de kinetoplastid familie. Respectievelijk deze protozoa groeien vrij in het cytoplasma of in parasitophorous vacuole van gastheercellen 10. Dicht gaten met plakband. Incubeer de T. cruzi-besmette eieren en mock-en niet-geïnfecteerde controle monsters op 37,5 ° C en 65% luchtvochtigheid gedurende 21 dagen. Bewaar de kuikens die de incubator gedurende 24 uur uitkomen en vervolgens bij 32 ° C gedurende drie weken. 3. Het verkrijgen van monsters voor DNA-extractie Perifere mononucleaire cellen werden verkregen van kippen: a)uitgebroed van T. cruzi geënte eieren; b) de controles, c) bespot ontvangen van 10 pi kweekmedium, d) geboren uit Lb geënte eieren, witte bloedcellen van kippen worden verwerkt voor DNA-extractie volgens een standaard protocol 11. Ook halen DNA van sperma van de hanen, en van onvruchtbare eicellen (<5 mm) verzameld van kippen uit eieren is geënt met T. cruzi, en van kippen uitgebroed zijn van de controle eieren 3, 4. Uittreksel kDNA van de T. cruzi epimastigote vormt en ook van Lb promastigoten, zoals elders 9 beschreven. 4. Primers en probes gebruikt De primers voor PCR-amplificaties en de thermische omstandigheden worden getoond in Tabel 1. De probes die in Southern blot hybridisatie waren: Wild-type minicircle (~ 1,4 kb) sequenties purigeschied van T. cruzi epimastigote vormen; Minicircle fragmenten (362 bp) verkregen door NSI ik samenvattingen van het wild-type kDNA; Nucleair DNA (nDNA) herhalende volgorde (188 bp) verkregen door amplificatie van de parasiet DNA met de Tcz1 / 2 primers. De probes werden gezuiverd uit 1% agarose gels 3. Wild-type minicircle (~ 0,820 kb) sequenties van Lb promastigoten. 5. PCR-analyses Uitvoeren standaard PCR-procedure met genomische DNA van geïnfecteerde kuikens en niet-geïnfecteerde controle en spotten met behulp van T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 en kDNA S35/S36 13 primers. Ook lopen PCR met genomische DNA's van kippen uitgebroed uit Lb geïnfecteerde-eieren met behulp van de protozoaire specifieke Lb3 en Lb5 primers (tabel 1). Merk reactiemengsel met 100 ng template DNA, 0,4 uM van elk paar primers, 2 U Taq DNA polymerase, dNTP 0,2 mM en 1,5 mM MgCl <sub> 2 25 ul eindvolume. Stel thermocycler programma 95 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van 30 sec bij 95 ° C/30 sec bij 68 ° C / 1 min bij 72 ° C met 5 min uiteindelijke verlenging voor koeling. Analyseren de amplificatieproducten in 1,3% agarose gel, waarvan een positief geladen nylon membraan (GE Life Sciences) door de alkalische methode hybridisatie met probes gelabeld met [α-32P] dATP Random Primer Labeling (Invitrogen , Carlsbad, CA). 6. Genomic Southern blots Gebruik Mbo I en / of met Eco RI (Invitrogen) enzymen die een verlaging van minicircles geïntegreerd DNA van lichaamsweefsels maken. Digest DNA van niet-geïnfecteerde controle pluimvee en uit pluimvee uit eieren is geënt met virulente T. cruzi vormt. Onder voorbehoud van de samenvattingen van het DNA van T. cruzi envan kip monsters aan elektroforese in 0,8% agarose gel bij 50 V overnacht bij 4 ° C. Overdracht gescheiden DNA-banden aan positief geladen nylon membraan. Hybridiseren van de DNA-banden met radio-gelabelde kDNA probe. Tweemaal wassen membraan gedurende 15 min bij 65 ° C met 2X SSC en 0,1% SDS, tweemaal gedurende 15 min bij 65 ° C elk 0,2 x SSC en 0,1% SDS en autoradiogram voor variabele tijd. 7. Gerichte Prime TAIL-PCR Verkrijgen amplificatie van de kDNA minicircle geïntegreerd in het genoom kip door een gewijzigde TAIL-PCR, waarbij primers kDNA combineert met specifieke primer bevat twee in drie inloop cycli genest PCR, zoals weergegeven in figuur 1. Primaire cyclus: Elke reactiezone bevat 200 ng template DNA, 2,5 mM MgCl2 en 0,4 uM van kDNA primers (S34 of S67), 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq platina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Gebruik kDNA primers in combinatie met 0,04 pM Gg primers (GG1 tot Gg6, tabel 1), afzonderlijk. Stel temperaturen 57,9 tot 60,1 ° C voor kDNA primers en 59,9 tot 65,6 ° C voor CR-1 primer. Merk op dat deze temperaturen zijn hoger dan de (~ 45 ° C) die nodig zijn voor de willekeurige gedegenereerde primers gebruikt in de TAIL-PCR-10. Gebruik temperatuur en cycli (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) beschreven in een vorige artikel 3. Middelbaar: verdunnen PCR uit primaire kringloop 01:40 (v / v) in water. kDNA primers S35 en S35 antisense vervangen het voorgaande, samen met dezelfde Gg primers. Tertiaire cyclus: verdunnen PCR producten van middelbaar 01:10 (v / v) in water en Gg primers met S67 antisense of S36 combineren afzonderlijk. Kloon de PCR-tertiaire cyclus producten: Clone direct in pGEM T makkelijk vector (Promega, Madison, WI)de producten van de laatste versterking die hybridiseren met kDNA sonde. Selecteer klonen door hybridisatie met kDNA sonde en volgorde. Valideer de tpTAIL-PCR in een mix van 300 pg van kDNA van T. cruzi met 200 ng DNA uit controlemonsters vogels nooit blootgesteld aan kDNA. De temperatuur en amplificatie cycli dezelfde gebruikt voor de test vogels DNA. 8. Ziekte van Chagas Clinic Manifestatie Monitor groei en ontwikkeling van kippen uitgebroed van T. cruzi besmette eieren en van gezonde controlepersonen uitgekomen van niet-geïnfecteerde eieren per dag voor sterfte en wekelijks voor de ziekte van manifestaties. Detect klinische afwijkingen in die kippen (figuur 2) en maak elektrocardiogram (ECG) opnames van de elektrische assen, hartslag en ritmestoornissen 3 te evalueren. Onderwerp kDNA-gemuteerde en regelt kippen maandelijks aan ECG-opnamen van augmented ventriculaire unipolar leidt aVF (linkerbeen), AVL (linkerarm), en AVR (rechterarm), en om te beoordelen afwijking van de gemiddelde elektrische as aan de linkerkant, dat is suggestief van hart uitbreiding 3. 9. Pathologie en immunochemische analyses Record hart en lichaamsgewicht indexen na de natuurlijke dood van kDNA gemuteerde kippen (figuur 3). Ook verkrijgen indexen voor de controle kippen van dezelfde leeftijd en geslacht. Neem secties van het hart, slokdarm, darmen, skeletspieren, longen, lever en nieren. Fix weefsel gebufferde 10% formaline (pH 7,4), sluit in paraffine en gesneden tot 4 urn dikke secties van hematoxyline-eosine (HE) kleuring en histologische analysen (figuur 3). Oogst en deelbaar weefsel van embryo's afkomstig zijn van eieren die geënt is met parasieten uiten β-galactosidase, en onder voorbehoud van X-Gal-vlek. 9 Bevestig de andere helft van het embryo weefsels in 10% formaline, pH 7,4 en verder als in stap 9.3. Snijd dunne 4μm paraffine ingebed weefsel sectie en monteren op glasplaatje voor microscopisch onderzoek. Incubate secties geeft X-Gal-gekleurde blauwe cellen met menselijke chagasic antiserum (1:1024 verdunning) tegen anti-T. cruzi antigeen. Was secties handomdraai met PBS, pH 7,4, 5 minuten per stuk. Vlek blauwe cellen van de embryo weefsels door tweede incubatie met fluoresceïne-geconjugeerd konijnen anti-humaan IgG. Was secties met PBS (stap 8), mount met dekglas en let op de blauwe cellen licht-groen op na onderzoek onder UV licht bij 502 nm golflengte, 200x vergroting, voor colocalizing T. cruzi in cellen van embryo's. 10. Fenotype cellen van het immuunsysteem in hartafwijkingen Fenotype immune effectoren cellen in weefselcoupes van het hart van kDNA-positieve en van de controle kDNA-negatieve kippen. Plaats de dia's metweefselsectie ingebed in paraffine bij 65 ° C gedurende 30 minuten tot was voorafgaande aan indiening in vier maal te wassen smelten 100% tot 70% xyleen en in absolute ethanol PBS gedurende 5 min elk. Spoel de dia's in gedestilleerd water, lucht droog, en behandelen met specifieke monoklonale antilichamen (fluoresceïne-of R-phycoerythrin-geconjugeerde monoklonale antilichamen) die u van SouthernBiotech, Birmingham, AL. Gebruik de muis anti-kip Bu-1 (Bu-1 een en Bu-1 b-allelen, de heer 70-75 kDa) Mab AV20 naar monomorfe determinant herkennen op de B-cel antigenen van inteelt kippen. Gebruik de muis anti-CD45 kip, Ig-isotype IgM1 κ die specifiek zijn voor kippen thymus lineage cellen (de heer 190-215-KDa variant). Gebruik de muis anti-kip TCRγδ + (heer 90-kDa heterodimeer) Mab die specifiek zijn voor thymus afhankelijk CD8α + T-cellen. Gebruik de muis anti-kip Mab CD-8 die specifiek zijn voor kip α-keten (de heer 34 kDa) e herkennene CD8 cellen thymocyten, milt, en andere weefsels. Gebruik de muis anti-kip KuL01 uitsluitend te herkennen monocyten / macrofagen van het fagocytensysteem. Was de dia driemaal met 0,1 M PBS, pH 7,4, 5 min elk na incubatie met de specifieke anti-fenotype antilichaam 90 min in een vochtige kamer. Monteer de dia met gebufferde glycerine voor het examen onder een TL-licht microscoop met emissie-filter met een golflengte van 567 en 502 nm, respectievelijk rood en groen fluorescentie-gelabelde cellen (figuur 4) op te sporen. 11. Gegevens Analyses Gebruik de kip genoom database ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) voor BLASTN sequentie-analyses. Gebruik clustalw uitlijningen om e-waarde scores te bepalen. Maken gebruik van de GIRI herhaal maskeren algoritme censor ( http://girinst.org/censor/index.php ) voor het lokaliseren van verschillende klassen van herhalingen in chimère sequenties. Gebruik van de Kinetoplastid Insertion en verwijdering Sequence Search Tool (KISS) om potentiële gRNAs identificeren in de kDNA sequenties, met behulp van WU-BLASTN-gemodificeerde-matrix 3. Gebruik T. cruzi sequenties http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas om te zoeken in gRNAs in de kDNA-gastheer-DNA hersenschimmen. 11,6) Gebruik Student's t en de Kolmorov-Smirnov testen, respectievelijk om significante verschillen tussen de afwijkingen van elektrische assen en tussen hart / lichaamsgewicht indexen verkregen in de experimentele en controlegroepen op te sporen en op te sporen sterfte ratio's significant verschillen tussen de groepen uitgekomen kippen van T. cruzi inoculated eieren en van de controles. 12. Representatieve resultaten De inenting van 100 virulent T. cruzi trypomastigotes in de luchtkamer van vruchtbare kippeneieren niet vermindert aanzienlijk de ratio's van kuikens in leven. Ongeveer 60% uitkomen gezonde kuikens en 40% kunnen embryo vloeibaar maken of het embryo dood te ondergaan bij het uitkomen. De overlevende kuikens behouden de kDNA minicircle volgorde geïntegreerd in het genoom. Er wordt echter verwacht dat een aantal kuikens zal met cardiomegalie en het niet sterven in de weken na het uitkomen. De resterende kuikens groeien naar buiten gezonde volwassenen. In alle stadia van het leven het DNA uit het bloed mononucleaire cellen zullen opleveren PCR-amplificatie van kDNA, maar niet nDNA. De doelgerichte-prime TAIL-PCR 3, 4 producten die worden gekloond en de volgorde ziet u de kDNA minicircles vooral geïntegreerd in coderende gebieden van macrochromosomes 1 tot 5. De kippen die meerdere kDNA integrations in genen die coderen voor de celgroei en-differentiatie, immuunsysteem regelgeving factoren, en DNA-herstel kandidaat zijn om afstoting van het zelf te onderzoeken weefsels (figuur 3) te ondergaan. Bijvoorbeeld, de kip waarin kDNA mutatie breuk van het dystrofinegen (figuur 5), dat codeert voor een eiwit dat de cytoskelet bindt aan de celmembraan, een kandidaat autoimmuun inflammatoire cardiomyopathie en mislukking ontwikkelen. Deze genomische veranderingen worden niet gezien in kuikens uitgebroed uit Lb besmette eieren. Er zijn verschillen tussen de T. cruzi en Lb kDNA minicircles; De T. cruzi k DNA minicircle gemiddeld 1,4 kb structuur met vier variabele regio (VR) afgewisseld met geconserveerde gebieden (CR) elk presenteren CSB1, CSB2 en CSB3 regio's, waar CA-rijke gebogen DNA worden beschouwd als specifieke sites voor de aanvang van de replicatie, transcriptie, recombinatie en laterale DNA-transfer <sup> 3, 4. Contrasterend de Lb kDNA minicircle (gemiddeld 820 bp) bevat een CR gevolgd door VR. CR heeft behouden CSB1 (GGGCGT) en CSB2 (CCCCGTTC) blokken, die verschillen van die in de T. cruzi minicircles 15, 16 en 17. Gezien het feit dat Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) toont 12 gen homologie met de T. cruzi is het denkbaar dat ofwel de Lb kDNA minicircle integreert in een veel lage frequentie, die niet zichtbaar zijn door de gebruikte technieken, of dat het kan, eventueel, niet te integreren in het genoom kip at all. Grondverf Doel-DNA Volgorde Tm * S 34 T. cruzi kDNA 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' 57,9 S 67 T.cruzi kDNA 5 'TTT GGT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' 60,1 S 35 T. cruzi kDNA 5 'ATA TAC ATG GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4 S 36 T. cruzi kDNA 5 'ATT GGT TCG GGG GTT GGT G 3' 57,9 Lb3 Lb kDNA 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' 55,9 Lb5 Lb kDNA 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' 61,4 Gg 1 Gallus gallus 5 'AGC TGA TAA TCC CAG AGG AGC 3' 60,1 Gg2 G. gallus 5 'AGC CTG CTC TGCTTT GAA A 3 ' 56,8 GG3 G. gallus 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' 60,1 GG4 G. gallus 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64,2 Gg5 G. gallus 3 'AGC AAC TCA GCG ACC TCC TT 5' 62,3 Gg6 G. gallus 3 'CTG GCA TTA TGA TTC ACA GGC A 5' 60,4 Tabel 1. Primes gebruikt in de PCR-amplificaties. * Tm = gemiddelde uitgloeitemperatuur ° C. Figuur 1. De tp TAIL-PCR-strategie gebruikt om Trypanosoma cruzi kDNA integratie te detecteren in de Gallus gallus genoom. A) een chimeer sequentie met een fragment van kDNA minicircle geconserveerd (donkerblauw) en variabele (lichtblauw) gebieden geïntegreerd in de locus NW_001471687.1 op chromosoom 4 (AY237306) van de kip 10 genoom (groen) werd gebruikt om de gastheer te verkrijgen specifieke primer sets (GG1 tot Gg6). B) De tp TAIL-PCR-amplificaties werden geïnitieerd (primaire cyclus) door hybridiseren van de minicircle specifieke S34 S67 of primers in combinatie met de kip-specifieke GG1 aan Gg6 primers. Verdunde producten die sjabloon voor de secundaire cyclus met de S35 (sense / antisense) primers en de combinaties van Gg primers. In de tertiaire cyclus een verdunning van de secundaire producten werd onderworpen aan amplificatie met kDNA S36 S67 of antisense primers in combinatie met de Gg primers. C) De amplificatieproducten werden gescheiden in 1% agarose gels en overgebracht naar nylon membranen, gehybridiseerd met de probe specifiek kDNA. Monsters die positief signaal werden gebruikt voor klonering van de aansluitpunt bepalen. De combinaties van kDNA en gerichte GG1 te Gg6 wordt boven op de gel. De sequentiële PCR-reacties versterkt doel kDNA-host DNA sequenties met kDNA minicircles (blauw) en het aviaire-sequentie (groen). (Herdrukt van PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figuur 2. Klinische verschijnselen van verminderde hartfunctie in een 9-maanden oude kip genetisch gemodificeerde door de integratie van de mitochondriale kDNA minicircle van T. cruzi. De arme bloedoxygenatie van de mitochondriale kDNA gemuteerde kip met een paarse kam in contrast met de heldere rode kam van de controle 9-maanden oude chicken vrij van schade aan het hart. (Modified van PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figuur 3. Gross en microscopische pathologie in Gallus gallus met kDNA mutaties. A) Cardiomegalie in een 9-maanden oude kip die overleed aan hartfalen. B) Controle hart van een niet-geïnfecteerd 9-maanden oude duivin. C) Verwerping van target heart cellen door cytotoxische lymfocyten: Een minimale afwijzing eenheid met labo van de target cellen door het immuunsysteem van lymfocyten is afgebeeld (cirkel). D) controle hart histologie (Gewijzigde van PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figuur 4. Immunocytochemische analyses van het immuunsysteem cellen geïnfiltreerd het hart van kDNA gemuteerde kip in figuur 3. A) CD45 + lymfocyten geïdentificeerd (pijlen) in het hart van lelingen door fycoerythrine gemerkte specifieke monoklonale antilichaam. B) CD8 + γδ immuun lymfocyten (pijlen) betrokken bij ernstig letsel van het hart. C) Overvloedige CD8α + T-cellen aanwezig zijn in ernstige beschadigingen met hart-cel labo. De inzetstukken geven de afwezigheid van cellen van het immuunsysteem in de controlegroep niet-geïnfecteerde kip hart (Modified van PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figuur 5. Chagas-achtige gedilateerde inflammatoire cardiomyopathie in een F2 nakomelingen met kDNA integratie in het dystrofine-gen. A) Dilated hart in een 10-maanden oude kippen bezetten het grootste deel van de borstholte (gewicht van het hart = 16 g). B) Dark ronde mononucleaire cellen infiltreert en vernietigt het myocard van de kDNA-gemuteerde kip. C) De normale grootte van het hart (gewicht 7 g) van een 10-maanden oude controle kip. D) De normale histologie van een controle-kip hart. (Modified van PLoS Neglected Tropical Ziekten 3). Figuur 6. Vergelijkende pathologie in kDNA-gemuteerde kip en bij de mens de ziekte van Chagas. A) Ernstige myocarditis en target heart cel labo in de kDNA-gemuteerde kip. B) Ernstige myocarditis en doelcel labo door het immuunsysteem van lymfocyten in het geval van Chagas hart-en vaatziekten. C) Verwerping van hartcellen door het immuunsysteem van lymfocyten in de kDNA-gemuteerde kip. D) Afwijzing van het hart cellen door het immuunsysteem van lymfocyten in de menselijke ziekte van Chagas. Gekleurd door hematoxiline en eosine. (Modified van Memorias doen Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).