기생충은 치킨 모델에서 유전 힘입어 면역 Chagas의 심장 질환을 유발

1. 기생충의 성장 T.의 trypomastigote 양식을 키운 cruzi Berenice와 β-갈락토-표현 Tulahuen T. murine 근육 세포의 cruzi MHOM/CH/00 C4 (L6)는 5퍼센트 10 % FSB, 100 IU / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 250 nm의 L-glutamin (산도 7.2)와 Dulbecco 최소한의 필수적인 매체 재배 37 CO 2 ° C. 뜨는 매체에서 자유 수영 trypomastigotes은 닭 계란을 예방하는 데 사용되었다. Leishmania braziliensis (LB) 20 % FBS으로 DMEM 재배 LTB300 주식을 성장. 기하 급수적인 성장 단계에있는 파운드의 promastigote 양식은 계란 9를 예방하기 위해 사용되었다. 2. 수정된 닭고기 계란에 기생충 접종 100 T.의 현탁액의 예방 cruzi 무대의 공기 챔버 위에 계란 껍질로 2 mm 직경의 구멍을 통해 배지 10 μl에 trypomastigotesX 비옥한 계란. 배아 세포로 악성 기생충 침략 및 복제는 비디오 S1에 표시됩니다. 제어 그룹은 다음과 같습니다) 제어 닭, B) 모의 제어 계란 배지 10 μl 수신, 배지 10 μl에 100 파운드의 promastigotes의 정지와 함께 주사 C) 스테이지 X 비옥한 계란 T.. cruzi와 LB는 kinetoplastid에 속합니다. 각각이 protozoans는 세포질 또는 호스트 세포 10 parasitophorous 공포에서 무료로 번식합니다. 접착 테이프로 구멍을 밀봉합니다. T.을 품어 cruzi에 감염된 계란과 모의와 감염되지 않은 컨트롤 샘플에서 37.5 ° C에서 21 일 동안 65 %의 습도. 삼 주 동안 32 ° C에서 24 H와 그 이후를 위해 인큐베이터에서 부화 병아리 보관하십시오. 3. DNA 추출을위한 구하기 샘플 말초 혈액 mononuclear 전지는 병아리에서 얻은되었습니다)T.에서 부화 cruzi 주사 계란, b)는 컨트롤, C) 배지 10 μl받는 mocks, D)를 LB 주사 계란에서 부화, 병아리에서 백혈구는 표준 프로토콜 11과 함께 따라 DNA의 추출을위한 처리됩니다. 수탉에서, 그리고 T.과 주사 계란에서 부화 암탉에서 수집한 unfertile oocytes (<5 ㎜)로부터 수집된 정액에서도 DNA를 추출 cruzi 및 제어 달걀 3, 4에서 부화 암탉에서. T.에서 kDNA을 추출 cruzi epimastigote 다른 곳에서 9 설명한 바와 같이, LB의 promastigotes에서, 또한 형성합니다. 4. 사용 Primers 및 프로브 PCR의 amplifications 및 열적 조건에 사용된 primers는 표 1에 표시됩니다. 남부 얼룩 hybridizations에 사용되는 프로브는 있었다 : 야생 형 minicircle이 (~ 1.4 KB) 푸리를 시퀀스T.부터 얘기 들이었다 cruzi epimastigote 양식; 나는 야생 형 kDNA의 소화 NSI 얻은 조각 (362 BP) Minicircle; 핵 DNA (nDNA) 반복 시퀀스 (188 BP) Tcz1 / 2 primers와 함께 기생충 DNA의 증폭에 의해 획득하였습니다. 프로브는 1% 아가로 오스 젤 3에서 정화되었다. LB의 promastigotes에서 야생 형 minicircle (~ 0.820 KB) 시퀀스. 5. PCR의 분석 감염된 병아리와 감염되지 않은 컨트롤의 게놈 DNAs으로 표준 PCR 프로 시저를 실행하고 T를 사용하여 조롱 cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 kDNA는 s35/s36 13 primers. 또한 protozoan 특정 Lb3 및 Lb5 primers (표 1)를 사용 LB 감염된-달걀에서 병아리 부화의 게놈 DNAs으로 PCR을 실행합니다. 100 NG 템플릿 DNA, primers, 2 U DNA 형성 촉매 장치의 DNA 중합 효소 0.2 MM dNTP, 각 쌍 0.4 μm의와 1.5 밀리미터 MgCl과 반응 믹스 만들기 <sUB 25 μL 최종 볼륨> 2. 68 ° 72에서 C / 1 분 ° C 냉장하기 전에 5 분, 최종 확장자에서 95시 5 분, 30 초 30주기 ° C/30 초 동안 95 thermocycler 프로그램 ° C를 설정합니다. 로 표시된 특정 프로브와 하이브 리다이 제이션을위한 알칼리성 방법으로 긍정적 – 충전 나일론 막 (GE 생명 과학)로 전송됩니다 1.3 % 아가로 오스 겔에 증폭 제품 분석 [α-32 P] 임의 프라이머 라벨 키트 (Invitrogen을 사용 dATP , Carlsbad, CA). 6. 게놈 남부 Blots Mbo I 및 / 또는 에코 RI와 (Invitrogen) 신체 조직의 DNA 샘플에 통합 minicircles에서 하나의 상처를 효소를 사용하십시오. 감염되지 않은 컨트롤 병아리에서와 병아리의 다이제스트 유전자가 악성 T.과 주사 계란에서 부화 cruzi가 형성하고 있습니다. 제목 T.로부터 DNA의 소화 cruzi과치킨 시험 샘플에서 4 ° C. 50 V, 하룻밤의 0.8 % 아가로 오스 겔 전기 영동에의 긍정적으로 충전 나일론 막으로 구분하여 DNA 밴드를 전송합니다. 라디오 분류 kDNA 프로브와 DNA의 밴드 잡종. 65 15 분 동안 두 번 멤브레인 씻어 ° 2X SSC와 0.1 % SDS와 C 두 번 65시 15 분 대한 ° C ~ 0.2X SSC와 0.1 % SDS, 그리고 시간 변수 기간 동안 autoradiograph 각. 7. 프라임 꼬리-PCR을 타겟 kDNA의 증폭에 2를 설정하는 구체적인 입문서로 kDNA의 primers를 결합한 수정 꼬리-PCR 기법에 의해 닭 게놈에 통합 minicircle 세 대형 PCR을 중첩주기, 그림 1에 표시된.를 구합니다 기본주기 : 각 반응은 200 NG 템플릿의 DNA, 2.5 밀리미터 MgCl 2, kDNA primers (S34 또는 S67)를 0.4 μm의 0.2 밀리미터 dNTPs, 2.5 U DNA 형성 촉매 플래티넘 (Invitrogen, Carlsbad, C를 포함). 별도로, GG primers (Gg1에 Gg6, 표 1)의 0.04 μm의와 함께 kDNA의 primers를 사용하십시오. 57.9에서 60.1로 온도를 설정합니다 ° kDNA primers 및 59.9에서 65.6까지 ° C CR-1 프라이머를위한 C #. 이러한 기온보다 높은 것을 참고 (~ 45 ° C)에 꼬리-PCR 10에 사용되는 임의의 퇴화한 primers를 위해 필요합니다. 온도 및 이전 논문 3에서 설명한 사이클 (MyCycle Thermocycler, 바이오 방사선 연구소, 헤라클레스, CA)를 사용합니다. 차주기 : 물에 기본주기 1시 40분 (V / V)에서 PCR 제품을 희석. kDNA primers S35과 S35 안티 센스 같은 GG를 primers와 함께 이전의 것들을 대체했습니다. 차주기 : 물속에서 보조 사이클 1시 10분 (V / V)에서 PCR 제품을 희석하고 별도로, S67 또는 S36 안티 센스와 함께 GG를 primers를 결합. 클론 직접 pGEM T 쉬운 벡터 (Promega, 매디슨, 위스콘신)보기 : PCR 차 사이클의 제품을 복제마지막으로 증폭의 제품은 것을 kDNA 프로브와 잡종. kDNA 프로브 및 시퀀스와 하이브리드화하여 클론을 선택합니다. T.에서 kDNA 300 PG의 혼합에 tpTAIL-PCR 유효성 검사 제어 조류의 DNA 200 NG와 cruzi는 kDNA에 노출하지 마십시오. 온도와 증폭 사이클이 시험 조류들의 DNA에 사용되는 동일합니다. 8. Chagas 질환 클리닉 발현 T.부터 부화 병아리의 성장과 발전을 모니터링 cruzi 계란은 감염과 건강한 컨트롤의 사망률과 질병 발현을위한 주간 동안 매일 비 감염된 계란에서 부화. 이들 병아리의 임상 이상 (그림 2)를 감지하고 electrocardiograph (ECG) 녹음은 전기 축, 심장 arrhythmias 속도와 3을 평가합니다. 제목 kDNA – 변이 및 확대 수술 심실 유엔의 ECG 녹음에 매달 닭을 제어ipolar는 aVF (왼쪽 다리), aVL (왼팔) 및 aVR (오른팔)을 주도하고, 심장 확대 3 암시입니다, 왼쪽으로 평균 전기 축의 편차를 평가합니다. 9. 병리 및 Immunochemical 분석 kDNA 변이된 병아리의 자연적인 죽음 이후에 기록 마음과 체중 인덱스 (그림 3). 같은 연령 및 성별의 제어 닭에도 인덱스를 구합니다. 심장, 식도, 내장, 골격근, 폐, 간 그리고 신장에서 섹션을 가져가라. 의 조직은 파라핀에 포함된 (산도 7.4) 10 % 포르말린 버퍼와 4 μm의 Hematoxylin-Eosin (HE) 염색법과 histological 분석 (그림 3)에 대한 두께 섹션에 잘라 수정. 배아의 수확 및 이등분 조직은 X-걸 – 얼룩에 β-갈락토을 표현 기생충과 주사 달걀, 대상에서 부화 9. 1 배아 조직의 나머지 절반을 고쳐서포르말린 0퍼센트, 산도 7.4 및 9.3 단계와 같이 진행합니다. 4μm 파라핀 얇은 임베디드 조직 부분을 잘라서 현미경 검사를위한 유리 슬라이드에 탑재합니다. 안티 T. 대한 인간 chagasic 항혈청 (1:1024 희석)와 X-걸 묻은 파란색 세포를 보여주 품어 섹션 cruzi 항원. PBS, 산도 7.4, 5와 순간은 각각 분 섹션을 씻으십시오. 플루오레신 – 복합 토끼 안티 – 인간 IgG와 두번째 부화하여 배아 조직의 파란색 셀을 청바지. coverslip으로 PBS (8 단계)로 마운트를 부분을 씻어과 T.을 colocalizing 위해 502 nm의 파장, 200x 배율,시 자외선 하에서 시험시 녹색 표시등 – 업 블루 세포를 관찰 배아 세포의 cruzi. 10. 심장 조직 손상의 표현형 면역 체계 세포 kDNA – 긍정의 및 제어 kDNA 음수 병아리의 심장 조직 섹션의 표현형 면역 effectors 세포. 함께 슬라이드를 삽입5 분마다 100 % 70 % 크실렌에서 그리고 절대적인 에탄올 PBS에서 네번이나 세차장에 제출 이전에 왁스를 녹여 30 분 동안 65 ° C에서 파​​라핀에 포함된 조직 절을 참조하십시오. 증류수, 공기 건조에 슬라이드를 씻어하고 SouthernBiotech, 버밍엄, AL에서 얻은 특정 단클론 항체 (플루오레신 또는 R-phycoerythrin-복합 단클론 항체)로 취급합니다. 안티 닭고기 부-1 (부 1과 부-1의 B 대립 유전자 씨 70-75 kDa) Mab AV20 근친 병아리의 B 세포 항원에 monomorphic 결정자을 인식 마우스를 사용합니다. 안티 닭고기 CD45, 마우스를 사용 IG isotype IgM1 κ 치킨 thymus 가계 세포 (미스터 190 215 KDa 변종까지) 특정. 마우스를 사용하여 안티 – 닭고기 TCRγδ + (씨 90 kDa의 heterodimer) Mab thymus 의존 CD8α + T 세포가 특정. 안티 닭고기 Mab가 CD-8 닭고기 α 사슬 (씨 34 kDa)에 구체적 주년을 인식 마우스를 사용하여thymocytes, 비장, 심장 및 기타 조직에서 전자 CD8 세포. 독점적 식세포 시스템의 monocytes / macrophages을 인식 마우스 안티 치킨 KuL01을 사용합니다. 0.1 M PBS, pH를 7.4, 5 분 습한 실내에서 90 분, 특정 안티 표현형 항체 각각 후에 부화와 슬라이드를 세 번 씻는다. 빨간색과 녹색 형광 라벨이 표시된 세포 (그림 4) 검색하는 각각 발광 파장 567의 필터와 502 nm의와 형광등 현미경 검사를위한 버퍼 글리세린과 함께 슬라이드를 조립. 11. 데이터 분석 닭 게놈 데이터베이스 (사용 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031을 BLASTn 시퀀스 분석을 위해). 전자 가치 점수를 결정하는 CLUSTALW 정렬을 사용합니다. GI를 직원으로 고용RI 반복 마스킹 알고리즘 (검열 http://girinst.org/censor/index.php 키메라 시퀀스의 반복의 다양한 클래스의 지방화를 위해). WU-Blastn으로 수정한 매트릭스 3의 도움으로, kDNA 시퀀스에 잠재 gRNAs를 식별할 수 Kinetoplastid 삽입 및 삭제 시퀀스 검색 도구 (키스)를 직원으로 고용하고 있어야합니다. T. 사용 cruzi 시퀀스 http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas kDNA-호스트의 DNA chimeras의 gRNAs 검색 기능을합니다. 11.6)를 사용하여 학생의 T와 실험 및 제어 그룹에서 얻어진 전기 축의 편차 사이 마음 / 몸 체중 인덱스 사이의 큰 차이를 감지하고, 사망률 비율에게 부화 병아리의 그룹 사이에 큰 차이를 감지하기 위해 각각 Kolmorov – 스미 르 노프 검사, T.의 cruzi 전계란 noculated와 컨트롤에서. 12. 대표 결과 100 악성 T.의 접종 비옥한 닭고기 달걀의 공기 챔버로 cruzi의 trypomastigotes 살아 부화 새끼의 상당히 비율을 감소하지 않습니다. 약 60 %가 건강한 새끼를 부화 40 %는 부화에서 배아 액화 또는 배아의 죽음을 받다 수 있습니다. 살아남은 새끼들은 게놈에 통합 kDN​​A의 minicircle 순서를 유지합니다. 그러나, 그것은 어떤 새끼가 부화 후 몇 주 동안 cardiomegaly과 실패로 죽을 것으로 예상된다. 남은 새끼들은 겉으로는 건강한 성인으로 성장할 것이다. 삶의 모든 단계에서 자신의 혈액 mononuclear 세포에서 추출한 DNA는 kDNA의 PCR 증폭을 양보했지만 nDNA하지 않습니다. 타겟팅 – 프라임 테일-PCR 3, 4 복제되고 제품과 순서는 kDNA가 5 macrochromosomes 1의 영역을 코딩에서 주로 통합 minicircles 표시됩니다. 여러 kDNA에게 I를 보여주는 병아리세포 성장 및 분화, 면역 시스템 조절 인자 및 DNA를 수리 코딩 유전자로 ntegrations 자기 대상 조직 (그림 3)의 거부를 받아야하는 후보입니다. 예를 들어, 세포막에 cytoskeleton에 바인딩 단백질을 코딩, dystrophin 유전자 (그림 5)의 파열과 함께 kDNA 변이를 보여주는 닭고기 면역 염증 심근증과 실패를 개발 후보입니다. 이러한 게놈 수정은 LB 감염된 달걀에서 부화 새끼로 볼 수 없습니다. T. 차이가 있습니다 cruzi 및 LB kDNA minicircles, T. 네 변수 지역 (VR)과 cruzi K 유전자 minicircle 평균 1.4 이하 구조는 CA 풍부한 구부러진의 DNA 복제의 개시에 대한 특정 사이트로 간주되는 보존되어 각 CSB1을 보여주고 지역 (CR), CSB2 및 CSB3 지역, 전사에 의해 interspersed 재조합, 그리고 측면의 DNA 전송을위한 <s> 3, 4까지. Contrastingly, LB kDNA minicircle (평균 크기는 820 BP)는 VR이어서 단일 CR 포함되어 있습니다. CR은 CSB1 (GGGCGT)와 T.의 사람과는 다릅니다 CSB2 (CCCCGTTC) 블록, 보존되어있다 cruzi minicircles 15, 16, 및 17. 그 LB CSB3을 고려하면 (GGGGTTGGTGTA) T.은 12 국세청의 상동을 보여줍니다 cruzi도 LB는 kDNA minicircle 사용한 기법으로 표시되지 않을 수 있습니다, 또는 그것은 가능성이 전혀 닭 게놈에 통합되지 않을 수도 훨씬 낮은 주파수에 통합되어 있다고 생각할 수있는 일이다. 뇌관 대상 DNA 순서 TM * S 34 T. cruzi kDNA 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' 57.9 S 67 T.cruzi kDNA 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' 60.1 S 35 T. cruzi kDNA 5 'ATA ATG 전술 GGG (T / G) GA GC GAT 3' 59.4 S 36 T. cruzi kDNA 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' 57,9 Lb3 LB kDNA 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' 55.9 Lb5 LB kDNA 5 'CTA AT & T는 GTG CAC GGG의 개그 G 3' 61.4 GG 1 gallus Gallus 5 'AGC TGA TCC TAA AGG 편대의 편대 장 AGC 3' 60.1 Gg2 gallus G. 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA 3 ' 56.8 Gg3 gallus G. 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' 60.1 Gg4 gallus G. 3 'GCT CTG C​​CT GGA TCA TTA GCT 5' 64.2 Gg5 gallus G. 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62.3 Gg6 gallus G. 3 'CTG TTA GCA GGC TGA TTC ACA 5' 60.4 표 1. Primes는 PCR Amplifications에 사용된다. * TM = 평균 어닐링 온도 ° C. 그림 1. TP 꼬리-PCR 전략 Gallus gallus 게놈에 Trypanosoma cruzi kDNA 통합을 감지하는 데 사용됩니다. ) kDNA의 조각과 키메라 시퀀스 닭고기 10 게놈 (녹색)의 염색체 4 (AY237306)에서 현장 NW_001471687.1에 통합 보존 (진한 파란색)와 변수 (하늘색) 지역 minicircle 것은 호스트를 얻기 위해 사용되었다 특정 프라이머 세트 (Gg1에 Gg6). B) TP 꼬리-PCR의 amplifications는 닭 고유 Gg1에 Gg6 primers와 함께 minicircle 특정 S34 또는 S67 primers의 어닐링에 의해 (주 사이클) 시작되었다. 희석 제품은 S35 (감각 / 안티 센스) primers와 GG의 primers의 조합과 함께 보조주기위한 템플릿을 제공했습니다. 차주기의 보조 제품의 희석은 GG의 프라이머와 함께 kDNA S36 또는 S67 안티 센스 primers로 증폭를 받게되었다의. C)이 증폭 제품은 1퍼센트 아가로 오스 젤로 분리되어 나일론 막에 양도, 특정 kDNA 프로브에 hybridized되었다. 긍정적인 신호를 보여주는 샘플 통합 지점을 결정하는 복제에 사용되었다. kDNA의 조합과 Gg1에 Gg6의 타겟은 젤 위에 표시됩니다. 연속적인 PCR 반응은 kDNA minicircles (파란색)과 조류 순서 (녹색)와 대상 kDNA – 호스트의 DNA 시퀀스를 증폭. (열대 질환에게 3 소외감 PLoS에서 재판). 그림 2. 유전자 mitochondrial kDNA의 통합에 의해 수정된 9 개월 된 닭고기의 장애 심장 기능의 임상 발현은 T.에서 minicircle cruzi. 컨트롤 9 개월 된 chicke의 밝은 붉은 빗과 자주색 빗의 대조를 보여주는 mitochondrial kDNA 변이된 닭고기 가난한 혈액 산소N 심장 손상으로부터 무료입니다. (열대 질환에게 3 소외감 PLoS에서 수정됨). 그림 3. kDNA 변이와 Gallus gallus의 병리 그로스와 미세한. ) Cardiomegaly 심장 마비로 사망 9 개월 된 암탉 인치 noninfected 9 개월 된 암탉으로부터 B)를 제어 마음. C) 세포 독성 lymphocytes하여 대상 심장 세포의 거절이 : 면역 lymphocytes하여 대상 세포 lyses있는 최소한의 거부 단위는 (동그라미)이 그려져 있습니다. D) 제어 마음 조직학 (열대 질병에게 3 소외감 PLoS에서 수정됨). 그림 4. 그림 3에 표시된 kDNA-변이된 닭고기의 마음을 침투 면역 체계 세포의 Immunocytochemical 분석합니다. ) CD45 + lymphocytes 마음 르로 (화살표) 식별phycoerythrin-라벨이 특정 단클론 항체에 의한 sions. B) CD8 + 마음의 심​​각한 파괴에 관여 γδ 면역 lymphocytes (화살표). C) 풍부한 CD8α + T 세포는 심장 세포 lyses과 심각한 병변에 존재. 삽입은 제어 감염되지 않은 닭 가슴 (열대 질병에게 3 소외감 PLoS에서 수정됨)에서 면역 체계 세포의 부재를 보여줍니다. 그림 5. dystrophin 유전자의 kDNA 통합과 F2 자손의 확장성 심근증 염증성 Chagas 같은. 흉강 (심장 중량 = 16 G)의 대부분을 차지하는 10 개월 된 닭고기의) 열려진 마음. B) 다크 원형 mononuclear 세포의 infiltrates 및 kDNA-변이된 암탉의 myocardium을 파괴합니다. 10 개월 된 제어 닭고기 C) 정상 심장 크기 (무게 7g). 제어 닭 심장 D) 일반 조직학. (PLoS에서 수정된 소외감 트로픽알 질환 3). 그림 6. kDNA – 변이된 닭고기와 인간 Chagas 질병의 비교 병리학. kDNA-변이된 닭고기의) 심한 심근염 및 대상 심장 세포 lyses. Chagas 심장 질환의 경우에 면역 lymphocytes에 의한 B) 심한 심근염 및 대상 세포 lyses. kDNA-변이된 닭고기의 면역 lymphocytes에 의해 심장 세포 C) 거부. 인간 Chagas 질병의 면역 lymphocytes에 의해 심장 세포 D) 거절. Hematoxilin과 Eosin으로 스테인드. (Memórias에서 수정 할 Instituto 오스왈드 크루즈, 리오데 자네이로 14).