寄生虫は鶏のモデルに遺伝的に駆動される自己免疫性シャーガス心臓病を誘発される

1。寄生虫の成長 T.のトリポマスティゴート形態を育てるクルーズベレニスとβ-ガラクトシダーゼ発現Tulahuen T.マウス筋細胞におけるクルーズ MHOM/CH/00 C4（L6）は5％、10％FSB、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 nMのL-グルタミン（pH 7.2）でダルベッコ最小必須培地中で培養37 CO 2℃上清培地中のフリースイミングtrypomastigotesは、​​鶏卵に接種するために使用した。 20％FBSを含むDMEM中で成長したブラジル·リーシュマニア（LB）LTB300株式を栽培しています。指数増殖期のLB前鞭毛型リーシュマニアフォームが卵9を接種するために使用されていました。 2。受精卵鶏卵の寄生虫の接種 100 Tの懸濁液を接種クルーズは、ステージの空気室の上に卵の殻に直径2mmの穴を介して培養液10μlにtrypomastigotesX肥沃な卵。胚細胞への病原性寄生虫の侵入と複製は、ビデオのS1に示されています。対照群は、次のとおりです。）制御鶏と、b）モックコントロールの卵は、培養培地の10μlを受信し、培養液の10μlの100ポンドの前鞭の懸濁液を接種c）はステージX受精卵T.。 cruzi及びLbはキネトプラストファミリーに属する。それぞれ、これらの原虫は、細胞質内または10宿主細胞のparasitophorous液胞の自由成長する。 粘着テープで穴をシールします。 T.をインキュベートクルーズトリパノソーマに感染した卵とモックと感染制御のサンプル37.5℃、21日間の65％の湿度。 3週間32℃で24時間、その後、インキュベーターで孵化雛を保持します。 3。 DNA抽出のための取得のサンプル末梢血単核細胞は、ニワトリから得られた。）Tから孵化cruziの接種卵、b）管理するステップと、c）の培養液10μlを受信モック、dは）LB接種卵から孵化し、鶏のから白血球細胞は、標準プロトコル11に記載のDNA抽出のために処理されます。 鶏から採取し、不毛の卵母細胞（<5ミリメートル）からT.を接種した卵から孵化した鶏から採取した精液からもDNAを抽出クルーズ 、制御卵3、4から孵化した鶏から。 TからkDNAを抽出します。他の9の説明に従って、 クルーズ上鞭毛型のフォームや、また、Lbとの前鞭から、。 4。使用したプライマーとプローブ PCR増幅と熱条件に対して使用したプライマーを表1に示す。 サザンブロットハイブリダイゼーションに使用されるプローブは次のとおりだった： 野生型minicircle（〜1.4キロバイト）配列をプリTからfied クルーズ上鞭毛型フォーム。 私は、野生型kDNAのダイジェストNSIによって得られた断片（362 bp）をMinicircle。 Tcz1 / 2プライマーを用いて寄生虫のDNAの増幅によって得られた核DNA（nDNA）反復配列（188 bp）を。プローブは、1％アガロースゲル3から精製した。 のLb前鞭から野生型minicircle（〜0.820キロバイト）シーケンス。 5。 PCR解析感染雛および非感染のコントロールからのゲノムDNAを標準的なPCR手順を実行し、Tを使ってモッククルーズ nDNA Tcz1 / 2 12とkDNA s35/s36 13プライマー。また、原生動物の特定のLB3とLB5プライマー（ 表1）を使用して、Lb は 、感染、卵から孵化したニワトリからのゲノムDNAでPCRを実行します。 100 ngのテンプレートDNA、プライマー、2 U Taq DNAポリメラーゼ、0.2mMのdNTPを、各ペアの0.4μMおよび1.5 mMのMgClを反応ミックスを作る<sUB 25μLの最終体積に> 2。 68℃72℃/ 1分°C冷蔵前に5分の最後の拡張子が付いた時に95℃で5分、30秒の30サイクル°C/30秒95のサーモプログラム°Cに設定します。 [α-32 P]で標識した特異的なプローブとのハイブリダイゼーションのためのアルカリ法ランダムプライマーラベリングキット（Invitrogen社製を使用してdATPをして正に帯電したナイロンメンブレン（GEライフサイエンス）に転送され1.3％アガロースゲルで増幅産物を分析する、カールスバッド、カリフォルニア州）。 6。ゲノムサザンブロット MBO Iおよび/ ​​またはEco RIで（Invitrogen）を体内組織のDNAサンプルに組み込まminicirclesのシングルカットを作る酵素を使用しています。 感染制御の鶏からと毒性T.を接種した卵から孵化したニワトリからDNAを消化クルーズでは、形成されます。 対象は TからのDNAの消化クルーズと鶏のテストサンプルから、4℃で50 Vで一晩0.8％アガロースゲルで電気泳動に正に荷電したナイロン膜に分離したDNAバンドを転送します。 ラジオラベルkDNAプローブを用いたDNAバンドをハイブリダイズする。 65℃で15分間回膜を洗浄°2X SSCおよび0.1％SDSでC、65倍で15分間°C 0.2×SSCおよび0.1％SDS、および時刻の変数期間のオートラジオグラフの各。 7。首相TAIL-PCR標的 3ウォークイン図1に示すように、PCRをネストされたサイクルで2を設定し、特定のプライマーとkDNAプライマーを組み合わせて変更されたTAIL-PCR法によりニワトリゲノムに組み込まれminicircle kDNAの増幅を取得します。 主要なサイクル：各反応は、200 ngのテンプレートDNA、2.5mMのMgCl 2、及びkDNAプライマー（S34またはS67）0.4μM、0.2 mMのdNTPsを、2.5 UのTaqプラチナ（Invitrogen社、カールスバッド、Cが含まれていますA）。別に、GGプライマー0.04μM（GG1にGg6、 表1）との組み合わせでkDNAプライマーを使用しています。 57.9から60.1に温度を設定温度kDNAプライマーおよび59.9から65.6°CのCR-1プライマーのC。これらの温度がより高いであることに注意してください（〜45°C）TAIL-PCR 10で使用される任意の縮重プライマーに必要です。前報3に記載された温度とサイクル（MyCycleサーモ、バイオ·ラッドラボラトリーズ、ヘラクレス、CA）を使用します。 二次サイクル：水の主要なサイクル1時40分（V / V）からのPCR産物を希釈します。 kDNAプライマーS35とS35センスは同じGGのプライマーと一緒に、以前のものに置き換えられました。 第三紀のサイクル：水の二次サイクル1:10（v / v）のからのPCR産物を希釈し、別々に、S67のアンチセンスまたはS36でGGのプライマーを組み合わせたものです。 クローン直接pGEM T easyベクター（プロメガ、マディソン、WI）において：PCR第三サイクル製品のクローンを作成するkDNAプローブとハイブリダイズ最後の増幅の産物。 kDNAプローブと配列とのハイブリダイゼーションによりクローンを選択します。 T.からkDNAの300 pgのミックスtpTAIL-PCRを検証するkDNAにさらされることはありませんコントロールの鳥からのDNA 200 ngのクルーズ 。温度と増幅サイクルは、テスト鳥のDNAのために使用されているのと同じです。 8。シャーガス病クリニックの現れ Tから孵化したニワトリの成長と発展を監視するクルーズでは、卵を感染と健常者の死亡や病気の症状のために毎週、毎日、非感染卵から孵化した。 それらの鶏の臨床的異常（ 図2）を検出し、電気軸、心拍数と不整脈3を評価するために心電図（ECG）記録を行います。 対象kDNA変異と拡張心室国連のECG記録に毎月の鶏を制御ipolarはAVF（左脚）、AVL（左腕）、およびAVR（右腕）を導き、心肥大3の示唆にある、左に平均電気軸のずれを評価する。 9。病理学と免疫化学的解析 kDNA変異鶏の自然死した後、レコード心と体重インデックス（ 図3）。同じ年齢、性別の制御鶏にもインデックスを取得します。 心臓、食道、腸、骨格筋、肺、肝臓、腎臓からセクションを取る。 の組織が ​​パラフィンに埋め込 ​​む、（pH7.4）を10％緩衝ホルマリン、4μmのヘマトキシリン-エオシン（HE）染色および組織学的分析（ 図3）の厚さの切片にカットを修正しました。 β-ガラクトシダーゼを発現する原虫を接種した卵とX-Gal-染色の対象から孵化した胚からの収穫とbisectが組織9。 1で胚組織の残りの半分を修正しました。ホルマリン0％、pH7.4で、ステップ9.3の手順に従ってください。 4μm薄いパラフィン包埋組織切片を切り取り、顕微鏡検査のためのガラススライド上にマウントします。 抗T.に対するヒトchagasic抗血清（1:1024希釈）でのX-Gal染色青色のセルを示す切片をインキュベートしクルーズ抗原 。 セクションのPBS、pH7.4の瞬間、5分ごとに洗浄します。 フルオレセイン標識ウサギ抗ヒトIgGを有する第2のインキュベーションによって胚組織に青色細胞を染色。 カバースリップを、PBS（ステップ8）を使ってマウントしセクションを洗い、Tを共局在のために502 nmの波長、200倍、少なくともUV光の下で審査時に緑色のライトアップ青色の細胞を観察する胚細胞でのクルーズ 。 10。心臓障害の表現型免疫系細胞 kDNA陽性から陰性コントロールkDNA鶏の心臓の組織切片における表現型免疫エフェクター細胞である。 でスライドを配置する5分ごとに100％〜70％キシレンにして、無水エタノール、PBSで4回洗浄の提出前にワックスを溶かすために30分間65℃でパラフィン包埋組織のセクションを参照してください。 蒸留水、空気乾燥でスライドをすすぎ、そしてSouthernBiotech、バーミンガム、アラバマ州から得られた特異的なモノクローナル抗体（フルオレセインまたはR-フィコエリスリン標識モノクローナル抗体）で扱います。 抗ニワトリは富栄-1（BU-1およびBu-1 bのアレル氏70から75 kDa）をしたMab AV20近交系ニワトリのB細胞抗原に単相行列を認識するマウスを使用しています。 抗ニワトリCD45、マウスを使用してIgアイソタイプIgM1κ鶏胸腺系統細胞（氏の190 215-kDaのバリアント）に固有の。 マウスを使用して、抗ニワトリTCRγδ+（氏は90-kDaのヘテロ二量体）のMab胸腺依存CD8α+ T細胞に特異的。 抗ニワトリのMab鶏α鎖（34 kDaの氏）へのCD-8固有の番を認識するマウスを使用して胸腺、脾臓、心臓、および他の組織内の電子CD8細胞。 排他的に食細胞系の単球/マクロファージを認識するマウス抗ニワトリKuL01を使用しています。 5分ごとに湿ったチャンバー内で90分間、特定の抗表現型抗体とインキュベートした後、0.1 M PBS、pH7.4でスライドを3回洗浄します。 赤と緑の蛍光標識された細胞（ 図4）を検出するために、それぞれ、発光波長567のフィルターと502 nmの蛍光灯顕微鏡下で試験するための緩衝グリセリンとスライドを組み立てます。 11。データ解析ニワトリゲノムデータベース（使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031を BLASTN系列分析のため）。 E値のスコアを決定するためにClustalWのアライメントを使用しています。 GIを採用RIリピートマスキングアルゴリズムは、（検閲http://girinst.org/censor/index.phpキメラ配列内の反復配列の異なるクラスのローカライズのため）。 WU-BLASTNで修飾されたマトリックス3の助けを借りて、kDNA配列において潜在的なgRNAsを識別するために、キネトプラスト挿入および削除シーケンスの検索ツール（KISS）を採用しています。 T.を使用して、クルーズシーケンス http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164から8-133-s1.fas kDNAホストのDNAキメラのgRNAs-で検索する。 11.6）をそれぞれ使用するスチューデントのtとKolmorovスミルノフテストを、電気軸の偏差の間に、実験群と対照群で得られた心臓/体重インデックスの間に有意差を検出すると、死亡率の孵化鶏の群間に有意差を検出するためにTからcruziの私noculated卵とコントロールから。 12。代表的な結果 100病原性Tの接種肥沃な鶏の卵の空気室にクルーズの trypomastigotesが大幅に生きている孵化した雛の比率を減らすことはありません。約60％のハッチ健康なヒナと40％が孵化時に胚の液化または胚死を受ける可能性があります。生き残った雛は、ゲノムに組み込まれkDNAのminicircleシーケンスを保持します。しかし、いくつかの雛が孵化後数週間で心臓肥大と失敗して死ぬことが期待されている。残りの雛は、外側に健康な成人に成長します。人生のすべての段階で、その血単核細胞から抽出したDNAは、PCR kDNAの増幅ではなく、nDNAが得られます。ターゲットを絞ったサブプライムTAIL-PCR 3、4、クローン化されている製品とシーケンスがkDNAが5にmacrochromosomes 1のコーディング領域を中心に統合されたminicircles表示されます。複数kDNA iを示す鶏細胞の増殖と分化、免疫系の調節因子、DNA修復をコードする遺伝子にntegrationsは、自己の標的組織（ 図3）の拒絶を受けるための候補である。たとえば、細胞膜に細胞骨格を結合するタンパク質をコードする、ジストロフィン遺伝子（ 図5）の破裂でkDNAの変異を示す鶏は、自己免疫炎症性心筋症や障害を開発するための候補である。 これらのゲノムの変更は、Lbは 、感染した卵から孵化した雛で見ていません。 T.の間に違いがあります。 クルーズと Lb kDNA minicircles、T.クルーズ K DNAは CA-豊富な曲がったDNAは、複製、転写開始のための特定のサイトと見なされている保存された各CSB1を提示する領域（CR）、CSB2、とCSB3地域が点在する4つの可変領域（VR）と平均1.4kbの構造をminicircle組換え、および横方向のDNAの転送のために<s> 3、4アップ。対照的に、Lbは kDNA minicircle（平均サイズは820 bp）をVRに続く単一のCRが含まれています。 CRはCSB1（GGGCGT） と Tのものと異なるCSB2（CCCCGTTC）ブロックを、保存されているクルーズ minicircles 15、16、17。 Lbは CSB3は（GGGGTTGGTGTA）Tに12 NTS相同性を示すことを考慮するとクルーズのいずれかLbが kDNA minicircleが使用されるテクニックによって表示されない場合がありますか、それは、多分、まったくニワトリゲノムに統合することはできませんことが多く、低周波で統合されていると考えています。 プライマー 標的DNA シーケンス TM * S 34 T. cruziの kDNA 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CCの3' 57.9 S 67 T.クルーズkDNA 5 'GGT TTT GGG AGG GG（G / C）（G / C）（T / G）TC 3' 60.1 S 35 T. cruziの kDNA 5 'ATA ATG TAC GGG（T / G）GA GAT GC 3' 59.4 S 36 T. cruziの kDNA 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' 57,9 LB3 ポンド kDNA 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' 55.9 LB5 ポンド kDNA 5 'CTA ATT GTG CAC GGGのGAG G 3' 61.4 GG 1 ガルスガルス 5 'TGA AGC TCC TAA AGG CAG AGC 3' 60.1 Gg2 G.ガルス 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA 3 ' 56.8 Gg3 G.ガルス 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' 60.1 Gg4 G.ガルス 3 'GCT CTG C​​CT TTA GGA TCA GCT 5' 64.2 Gg5 G.ガルス 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TTの5' 62.3 Gg6 G.ガルス 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA 5' 60.4 表1。素数は、PCR増幅に使用されます。 * Tm値=平均アニーリング温度℃、 図1。TP TAIL-PCRの戦略は、 セキショクヤケイのゲノムにトリパノソーマ kDNA統合を検出するために使用される。 A）kDNAのフラグメントとのキメラ配列が保存さminicircle（ダークブルー）とチキン10ゲノム（緑）の4番染色体（AY237306）で座NW_001471687.1に統合された変数（ライトブルー）の地域のホストを取得するために使用した特異的プライマーセット（GG1にGg6）。 B）TP TAIL-PCR増幅は鶏特有のGG1にGg6プライマーとの組み合わせでminicircle特有のS34またはS67のプライマーのアニーリングによる（一次サイクル）を開始しました。希薄化後の製品は、S35（センス/アンチセンス）プライマーとGGのプライマーの組み合わせで二次サイクルのテンプレートを提供した。第三サイクルでは、二次製品の希釈は、GGのプライマーとの組み合わせでkDNA S36またはS67のアンチセンスプライマーを用いて増幅を行っただ。 C）これらの増幅産物を1％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に転写し、特定のkDNAプローブとハイブリダイズさせた。肯定的な信号を示すサンプルは、統合のポイントを決定するためのクローニングのために使用された。 kDNAとGg6にGG1をターゲットの組み合わせは、ゲルの上に表示されます。シーケンシャルPCR反応はkDNA minicircles（青）と鳥類のシーケンス（緑）を使用してターゲットkDNAホストのDNA配列を増幅した。 （ 熱帯病 3 放置PLoSのより転載）。 図2：遺伝子組換えT.からミトコンドリアkDNA minicircleの統合によって変更された9ヶ月の鶏における障害心機能の臨床症状クルーズ 。コントロール9ヶ月歳chickeの鮮やかな赤い櫛と櫛紫のコントラストを示すミトコンドリアkDNA変異鶏の貧しい人々の血液の酸素化nは心臓の損傷から無料。 （ 熱帯病 3 放置PLoSのから変更された）。 図3。kDNA変異を有するセキショクヤケイの病理肉眼的及び顕微鏡。 A）心肥大、心不全で死亡した9ヶ月歳編インチB）非感染9ヶ月の鶏から心臓を制御します。 C）細胞傷害性リンパ球による標的の心臓細胞の除去：免疫リンパ球による標的細胞の溶解すると最小限の除去単位（円）描かれています。 D）コントロール心臓組織（ 熱帯病 3 放置PLoSのから変更された）。 図4図3に示すようにkDNA変異鶏の心臓部を浸潤免疫系細胞の免疫細胞化学的解析。心臓ルで識別される）CD45 +リンパ球（矢印）フィコエリスリンで標識した特異的モノクローナル抗体によるsions。 B）CD8 +心臓の深刻な破壊に関与するγδ免疫リンパ球（矢印）。 C）豊富なCD8α+ T細胞は、心臓の細胞溶解すると重篤な病変に存在する。インサートはコントロール感染ニワトリの心臓における免疫系細胞（ 熱帯病 3 放置PLoSのから変更された）の不在を示しています。 図5。ジストロフィン遺伝子のkDNAを統合したF2子孫で拡張型心筋炎症性心筋症シャーガス病のような。胸腔（心臓重量= 16グラム）の大半を占める10カ月齢の鶏のA）拡張型心筋症心臓。 B）ダーク円形単核細胞の浸潤とkDNA変異鶏の心筋を破壊します。 10ヶ月歳の制御鶏のC）正常な心臓の大きさ（重さ7グラム）。 D）制御ニワトリの心臓の正常組織には。 （PLoSの顧みられない熱帯から変更されたアル症3）。 図6。kDNA変異ニワトリとヒトのシャーガス病の比較病理学。 kDNA変異鶏のA）重症心筋炎とターゲットの心臓細胞の溶解する。シャーガス心臓病の場合、免疫リンパ球によるB）重症心筋炎と標的細胞の溶解する。 kDNA変異鶏の免疫リンパ球による心筋細胞のC）除去。ヒトのシャーガス病の免疫リンパ球による心筋細胞のD）除去。ヘマトキシリン​​とエオシンで染色した。 （Memóriasから変更されたかセルバンテスオズワルド·クルス 、リオデジャネイロ14）。