טפיל מושרה מונע גנטית אוטואימונית מחלות לב Chagas דגם עוף

1. צמיחה של טפילים גדלים צורות trypomastigote של ט ' cruzi ברניקי ו-β-galactosidase להביע Tulahuen ט cruzi MHOM/CH/00 C4 בתא השריר Murine (L6) טיפח בינוני Dulbecco חיוני מינימלי עם FSB של 10%, 100 IU / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 250 ננומטר L-glutamin (pH 7.2), 5% CO 2 ב 37 ° C. חופשי שחייה את trypomastigotes במדיום supernatant שימשו לחסן ביצי תרנגולת. לגדול שושנת יריחו braziliensis (LB) LTB300 המניות גדל DMEM עם FBS 20%. Promastigote Lb טופס בשלב גידול אקספוננציאלי שימש מחסן ביצים 9. 2. טפיל הרכבת חיסון של ביצי תרנגולות מופרות לחסן השעיית 100 ט cruzi trypomastigotes ב μl 10 של המדיום תרבות דרך החור 2 מ"מ קוטר פגז לתוך הביצה על גבי תא האוויר הבמהצילומי ביצים פוריות. הפלישה ושכפול של טפילים אלימים לתוך תאים עובריים מוצגים S1 וידאו. בקבוצת הביקורת הם כדלקמן: א) תרנגולות שליטה, ב) ביצים שליטה מדומים מקבלת 10 μl של המדיום תרבות, ג) שלב צילומי ביצים פוריות מחוסן עם ההשעיה של 100 promastigotes ליברות ב 10 μl של המדיום תרבות ט '. cruzi ו Lb שייכים למשפחת kinetoplastid. בהתאמה, פרוטוזואה אלה גדלים חופשי בציטופלסמה או vacuole parasitophorous של תאים המארח 10. לאטום חורים עם דבק. דגירה ט cruzi נגועים ביצים דגימות שליטה מדומה נגוע ב 37.5 מעלות והלחות 65% במשך 21 ימים. לשמור על הגוזלים הבוקעים בחממה במשך 24 שעות ולאחר מכן ב 32 ° C במשך שלושה שבועות. 3. דוגמאות קבלת להפקת DNA כדוריות דם היקפיים mononuclear התקבלו תרנגולות:)בקעו ט ביצים cruzi מחוסן, ב) שולטת ג) ולועג לו בעת ובעונה שקיבלו 10 μl של המדיום תרבות, ד) בקעו מן הביצים ליברות מחוסן, תאים דם לבנים עופות מעובדים להפקת DNA על פי פרוטוקול סטנדרטי עם 11. תמצית ה-DNA גם זרע שנאספו תרנגולים, ומן ביציות unfertile (<5 מ"מ) שנאספו התרנגולות בקעו מן הביצים מחוסן עם ט ' cruzi, ומן התרנגולות בקעו מן הביצים בקרה 3, 4. חלץ kDNA מ ט cruzi epimastigote טפסים, כמו כן, מן promastigotes LB, כמתואר במקומות אחרים 9. 4. Primers ו בדיקות משומשים פריימרים המשמשים את ה-PCR amplifications ותנאי תרמית מוצגים בטבלה 1. בדיקות המשמשים הכלאות למחוק הדרום היו: Wild-type minicircle (~ 1.4 KB) רצפים פוריfied מ ט cruzi epimastigote צורות; Minicircle שברים (362 נ"ב) מתקבל על ידי NSI אני מעכל של kDNA wild-type; הגרעין DNA (nDNA) רצף שחוזר על עצמו (188 נ"ב) מתקבל על ידי הגברה של DNA הטפיל עם Tcz1 / 2 פריימרים. הבדיקות היו מטוהרים מ 1% agarose ג'ל 3. Wild-type minicircle (~ 0.820 קילו) רצפים של promastigotes פאונד. 5. ניתוח ה-PCR הפעלה רגילה הליך PCR עם DNAs הגנומי של אפרוחים נגועים בקרות נגוע ו ללעוג באמצעות ט cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 ו kDNA s35/s36 13 פריימרים. כמו כן, להפעיל PCR עם DNAs הגנומי של התרנגולות שבקעו מן ליברות נגוע ביצי באמצעות protozoan ספציפיים Lb3 ו Lb5 primers (טבלה 1). הפוך את תערובת התגובה עם דנ"א 100 תבנית נג, 0.4 מיקרומטר של כל זוג פריימרים, 2 U Taq פולימראז ה-DNA, 0.2 מ"מ dNTP, ו 1.5 מ"מ MgCl <sUB> 2 בנפח 25 μL הסופי. הגדרת תוכנית thermocycler עבור 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של 30 שניות על 95 ° C/30 שניות על 68 ° C / 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס עם סיומת 5 דק 'לפני הגמר קירור. לנתח את מוצרי הגברה ב 1.3% agarose ג'ל, אשר מועבר קרום ניילון חיובי טעון (GE מדעי החיים) בשיטת בסיסי על הכלאה עם בדיקות ספציפיות שכותרתו עם [α-32-P] dATP אקראי באמצעות סימון פריימר Kit (Invitrogen , Carlsbad, CA). 6. כתמים הדרום גנומית השתמש MBO אני ו / או עם RI אקו (Invitrogen) אנזימים לבצע חתכים בודדים minicircles משולבים דגימות DNA של רקמות הגוף. ה-DNA תקציר מתרנגולות בקרה נגוע ומ התרנגולות בקעו מן הביצים מחוסן עם ט ארסית cruzi יוצר. נושא מעכל מה-DNA של ט ' cruzi ודגימות הבדיקה עוף על אלקטרופורזה ב 0.8% agarose ג'ל ב 50 V לילה ב 4 ° C. העברת להקות ה-DNA מופרדים ל קרום ניילון במטען חיובי. להכליא את להקות ה-DNA עם התווית רדיו kDNA בדיקה. לשטוף את הממברנה פעמיים במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס עם 2X SSC ו -0.1% SDS, פעמיים במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כל אחד עם 0.2X SSC ו -0.1% SDS, ו autoradiograph לתקופות משתנות של זמן. 7. ממוקד ראש זנב PCR להשיג הגברה של kDNA minicircle משולב לתוך הגנום עוף בטכניקה זנב PCR שונה, המשלבת primers kDNA עם פריימר ספציפי קובע 2 ב 3 הליכה, במחזורים מקוננים PCR, כפי שמוצג באיור 1. ראשי מחזור: התגובה כוללת 200-DNA תבנית נג, 2.5 מ"מ MgCl 2, ו -0.4 מיקרומטר של kDNA primers (S34 או S67), 0.2 מ"מ, 2.5 dNTPs U פלטינום Taq (Invitrogen, קרלובי וארי, Cא). השתמש primers kDNA בשילוב עם 0.04 מיקרומטר של GG primers (Gg1 כדי Gg6, טבלה 1), בנפרד. הגדר בטמפרטורות 57.9-60.1 מעלות צלזיוס למשך kDNA primers ו 59.9-65.6 מעלות צלזיוס למשך פריימר CR-1. שים לב כי טמפרטורות אלו גבוהות יותר מאשר אלו (~ 45 ° C) דרוש primers התדרדרה שרירותיים המשמשים 10 זנב PCR. השתמש טמפרטורה מחזורים (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA) המתואר במאמר הקודם 3. מחזור משני: מדולל מוצרי ה-PCR ממעגל 1:40 הראשי (V / V) במים. kDNA primers S35 ו S35 antisense החליף הקודמים, יחד עם primers הגנרלגוברנמן אותם. מחזור שלישוני: מדולל מוצרי ה-PCR ממעגל 1:10 משני (V / V) במים ולשלב primers הגנרלגוברנמן עם antisense S67 או S36, בנפרד. לשכפל את מוצרי ה-PCR מחזור שלישוני: המשובטים ישירות וקטור T pGEM קל (Promega, מדיסון, WI)תוצרי ההגברה האחרון להכליא עם kDNA בדיקה. בחר שיבוטים על ידי הכלאה עם החללית kDNA ורצף. אמת tpTAIL-PCR בתערובת של PG 300 של kDNA מ ט cruzi עם נ"ג 200 של ה-DNA של ציפורים שליטה אף פעם לא נחשף kDNA. מחזורי טמפרטורה הגברה זהים המשמש DNA הציפורים של הבדיקה. 8. מרפאת Chagas מחלות ביטוי מעקב אחר הגדילה וההתפתחות של התרנגולות בקעו ט cruzi נגוע ביצים של פקדים בריא בקעו מן הביצים הלא נגועים היומי תמותה שבועי גילויי המחלה. זיהוי ליקויים קליניים עופות אלה (איור 2) ולעשות electrocardiograph (ECG) הקלטות על מנת להעריך את הצירים חשמל, קצב הלב ואת בקצב הלב 3. נושא kDNA-מוטציה ושולטת תרנגולות חודשיים להקלטות של א.ק.ג. מוגבר חדרית האו"םipolar מוביל AVF (רגל שמאל), AVL (יד שמאל), ו – AVR (יד ימין), וכדי להעריך את הסטייה של ציר חשמלי ממוצע שמאלה, וזה מרמז על הגדלה לב 3. 9. הפתולוגיה ואת Immunochemical ניתוח שיא לב ומשקל האינדקסים הגוף לאחר מותם הטבעי של תרנגולות kDNA מוטציה (איור 3). להשיג אינדקסים גם תרנגולות שליטה של ​​גיל ומין זהים. לקחת קטעים מתוך הלב, הוושט, המעי, שרירי השלד, הריאות, הכבד, הכליות. תיקון רקמות שנאגרו 10% פורמלין (pH 7.4), להטביע ב פרפין וחותכים ל -4 חלקים עבים מיקרומטר עבור Hematoxylin-Eosin (he) מכתים וניתוח היסטולוגית (איור 3). קציר ולחצות רקמות מעוברים בקעו מן הביצים מחוסן עם טפילים המבטאים β-galactosidase, ובכפוף X-גלאון הכתם. 9 לתקן את החצי השני של רקמות העובר ב 10% פורמלין, pH 7.4 ולהמשיך כמו בשלב 9.3. גזור 4μm פרפין דק מוטבע בחלק רקמות לעלות בשקופית זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית. סעיפים דגירה מראה X-גלאון מוכתמים תאים כחולים עם אדם chagasic antiserum (1:1024 דילול) נגד נגד ט ' cruzi אנטיגן. לשטוף חלקים הרף עין עם PBS, pH 7.4, 5 דקות כל אחד. כתם כחול תאים ברקמות העובר על ידי הדגירה 2 עם ארנב fluorescein-מצומדות נגד לנוגדנים אנושיים. לשטוף חלקים עם PBS (שלב 8), הר עם coverslip ולבחון את התאים בצבע תכלת, ירוק עד בבדיקה תחת אור UV באורך גל 502 ננומטר, 200x הגדלה, עבור colocalizing ט cruzi בתאים עובריים. 10. החיסון פנוטיפ מערכת תאים הפצעים לב החיסון פנוטיפ effectors תאים בסעיפים רקמות של הלב של kDNA חיובי ומתוך שליטה kDNA שלילי תרנגולות. מניחים את השקופיות עםרקמות בחלק מוטבע פרפין ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להמיס שעווה הקודם להגשת בארבעה שוטף ב קסילן 100% עד 70% ואז באתנול PBS מוחלטת 5 דקות כל אחד. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים, אוויר יבש, לטיפול עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים (fluorescein או R-phycoerythrin-מצומדות נוגדנים חד שבטיים) המתקבלים SouthernBiotech, בירמינגהם, אל. השתמש בעכבר נגד עוף Bu-1 (Bu-1 A ו-bu-1 אללים B, מר 70-75 KDA) מאב AV20 להכיר הקובע חד צורתי על אנטיגנים תא B של עופות טהורים. השתמש בעכבר נגד עוף CD45, איג isotype IgM1 κ ספציפי התימוס עוף תאים השושלת (190 מר החלופה 215-KDA). השתמש בעכבר נגד עוף TCRγδ + (מר 90-kDa heterodimer) מאב ספציפי התימוס תאים התלויים + CD8α טי. השתמש בעכבר נגד עוף מב CD-8 ספציפית לשרשרת עוף α (מר 34 KDA) מזהה הדואר CD8 התאים thymocytes, הטחול, הלב ורקמות אחרות. השתמש נגד עוף KuL01 העכבר כדי לזהות באופן בלעדי מונוציטים / מאקרופאגים של מערכת תא בלען. לשטוף את השקופית שלוש פעמים עם 0.1 מ 'PBS, pH 7.4, 5 דקות אחרי כל דגירה עם נוגדנים נגד פנוטיפ ספציפי 90 דקות בתא לחות. להרכיב את השקופית עם גליצרין שנאגרו לבחינה תחת מיקרוסקופ אור ניאון עם מסנן פליטה באורך גל 567 ו 502 ננומטר, בהתאמה, על מנת לזהות תאים הקרינה, שכותרתו אדום וירוק (איור 4). 11. ניתוח נתונים השתמש הגנום עוף מסד נתונים ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) עבור ניתוחים BLASTn ברצף. השתמש מערכים CLUSTALW לקבוע דואר ערך ציוני. מעסיקים GIחזור על RI אלגוריתם מיסוך צנזור ( http://girinst.org/censor/index.php ) עבור לוקליזציה של סוגים שונים של חזרות של רצפים chimeric. מעסיקים הכניסה Kinetoplastid ורצף מחיקת חיפוש כלי (KISS) לזהות gRNAs פוטנציאליים רצפי kDNA, בעזרת WU-Blastn-Modified-מטריקס 3. השתמש ט cruzi רצפים http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133 s1.fas לחפש ב-gRNAs ב kDNA מארח מפלצות ה-DNA. 11.6 t) סטודנט השימוש שעשה ואת Kolmorov-סמירנוב בדיקות, בהתאמה, כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין הסטיות של צירים חשמליים בין הלב / הגוף אינדקסים משקל שהושגו בין קבוצות הניסוי והבקרה, וכן לזהות יחס התמותה הבדלים משמעותיים בין קבוצות של תרנגולות בקעו מ ט אני cruzinoculated ביצים מן הביקורת. 12. נציג תוצאות חיסון של 100 ט ארסית trypomastigotes cruzi לתוך תא האוויר של ביצי תרנגולת הפוריים אינו מפחית באופן משמעותי את היחס בין הגוזלים שבקעו חיים. כ 60% בוקעים הגוזלים בריאים 40% עשוי לעבור עיבוי העובר או מוות העובר על הבקיעה. הגוזלים ששרדו לשמור על רצף minicircle kDNA משולב בגנום. עם זאת, צפוי כי מספר הגוזלים ימותו עם cardiomegaly וכישלון בשבועות לאחר הבקיעה. הגוזלים הנותרים יגדל מבוגרים בריאים כלפי חוץ. בכל שלבי החיים שחולצו מן ה-DNA בתאי הדם שלהם mononuclear תניב הגברה PCR של kDNA, אבל לא nDNA. ממוקד ראש הממשלה זנב PCR 3, 4 המוצרים משובטים ואת רצף יראה kDNA minicircles משולבים בעיקר קידוד אזורי macrochromosomes 1 עד 5. את התרנגולות מראה kDNA מרובים אניntegrations לתוך גנים קידוד עבור צמיחת תאים והתמיינות, ויסות מערכת החיסון גורמים במערכת, ותיקון ה-DNA הם מועמדים לעבור דחיית רקמות היעד עצמי (איור 3). כך, למשל, עוף מראה מוטציה kDNA עם קרע של גן הדיסטרופין (איור 5), קידוד חלבון זה נקשר cytoskeleton אל קרום התא, הוא מועמד לפתח cardiomyopathy דלקתית כישלון אוטואימוניות. שינויים אלה הגנומי לא נראים הגוזלים שבקעו מן הביצים ליברות נגועים. ישנם הבדלים בין ט ' cruzi ו Lb kDNA minicircles, ט ' cruzi K-DNA minicircle בממוצע 1.4 קילו עם מבנה באזור 4 משתנה (VR) וביניהם לפי אזורים המשתמרים (CR) כל המציגים CSB1, CSB2 ו CSB3 אזורים, שבהם CA-DNA עשיר כפוף נחשבים לאתרים ספציפיים חניכה של שכפול, שעתוק, רקומבינציה, וכן להעברת דנ"א לרוחב <sאת 3>, 4. וחשוף, Lb kDNA minicircle (גודל ממוצע 820 נ"ב) מכיל CR אחד ואחריו VR. CR יש שימור CSB1 (GGGCGT) ו CSB2 (CCCCGTTC) בלוקים, שהם שונים מאלה של ט ' cruzi minicircles 15, 16, ו 17. בהתחשב בכך Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) מראה 12 הומולוגיה NTS ל ט cruzi מתקבל על הדעת כי גם Lb kDNA minicircle המשלבת בתדירות נמוכה יותר, אשר לא יכול להיות גלוי על ידי טכניקות בשימוש, או שהוא יכול, אולי, לא להשתלב בגנום עוף בכלל. צבע יסוד יעד ה-DNA רצף אני * S 34 ט cruzi kDNA 5 "ACA ACC המרכז לאמנות עכשווית CCA ATC GAA CC 3" 57.9 S 67 טcruzi kDNA 5 "GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3" 60.1 S 35 ט cruzi kDNA 5 עטא ATG TAC GGG (T / G) GA גת GC 3 " 59.4 S 36 ט cruzi kDNA 5 "GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3" 57,9 Lb3 Lb kDNA 5 "GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3" 55.9 Lb5 Lb kDNA 5 "CTA ATT GTG CAC GAG GGG G 3" 61.4 GG 1 גאלוס גאלוס 5 'AGC TGA TCC ט.א.א. AGG החטיבה AGC 3 " 60.1 Gg2 גאלוס ג 5 "CTG AGC CTC TGCTTT GAA 3 " 56.8 Gg3 גאלוס ג 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 " 60.1 Gg4 גאלוס ג 3 "GCT CTG CCT tta GGA TCA GCT 5" 64.2 Gg5 גאלוס ג 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5 " 62.3 Gg6 גאלוס ג 3 "CTG tta GCA TGA GGC TTC ACA 5" 60.4 מספרים ראשוניים לוח 1. משמש את Amplifications ה-PCR. * אני = חישול בטמפרטורה הממוצעת ° C. באיור 1. אסטרטגיה זנב PCR TP המשמשים לאיתור Trypanosoma שילוב cruzi kDNA לתוך הגנום גאלוס גאלוס. א) רצף chimeric עם שבר של kDNA minicircle המשתמרים (כחול כהה) לבין משתנה (תכלת) באזורים המשולבים לוקוס NW_001471687.1 על כרומוזום 4 (AY237306) של הגנום עוף 10 (ירוק) היה רגיל לקבל את המארח פריימר קבוצות ספציפיות (Gg1 כדי Gg6). ב) זנב-PCR את amplifications TP יזמו (מחזור ראשוני) על ידי חישול של minicircle ספציפיים S34 או S67 primers בשילוב עם עוף ספציפיים Gg1 כדי Gg6 primers. מוצרים מדולל בתנאי תבנית מחזור המשני S35 (במובן / antisense) primers ואת שילובים של primers הגנרלגוברנמן. במחזור שלישוני דילול של מוצרים משניים היה נתון הגברה עם kDNA S36 או S67 primers antisense בשילוב עם צבע יסוד GGs. ג) מוצרים אלה הגברה הופרדו 1% agarose ג'ל והועברו קרום ניילון, הכלאה עם החללית kDNA ספציפי. דוגמאות המציגות איתות חיובי שימשו שיבוט כדי לקבוע את נקודת האינטגרציה. השילובים של kDNA ממוקד Gg1 כדי Gg6 מוצגים על גבי ג'ל. התגובות ברצף ה-PCR מוגבר kDNA-מארח היעד רצפי DNA עם kDNA minicircles (כחול) את רצף העופות (ירוק). (התפרסם מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות 3). איור 2. הביטויים הקליניים של תפקוד הלב לקוי של עוף 9 חודשים בת מהונדסים גנטית על ידי שילוב של kDNA המיטוכונדריה minicircle מ ט cruzi. חמצון דם לקויה של עוף kDNA המיטוכונדריה מוטציה מראה כמה ניגודים מסרק במסרק סגול אדום בהיר שליטה 9 חודשים בת chicken ללא נזק ללב. (שונה מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות 3). איור 3. גרוס מיקרוסקופית פתולוגיה גאלוס גאלוס עם מוטציות kDNA. א) ב cardiomegaly חן 9 בן חודש שמת מדום לב. ב) בקרת הלב של חן 9 חודשים בת noninfected. ג) דחיית לתאי לב היעד על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים: יחידת דחייה מינימלית עם lyses של התאים היעד על ידי לימפוציטים החיסונית מתואר (מעגל). ד) בקרת לב היסטולוגיה (השתנה מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות 3). איור 4. ניתוחים Immunocytochemical של תאים של המערכת החיסונית שחדר הלב של עוף kDNA-מוטציה שמוצג באיור 3. א) CD45 + הלימפוציטים זיהו (חיצים) בלב להליה על ידי נוגדנים phycoerythrin שכותרתו חד שבטי ספציפי. ב) CD8 + γδ לימפוציטים החיסונית (חיצים) המעורבים הרס חמור של הלב. ג) שפע CD8α + בתאי T הנמצאים נגעים קשים עם lyses סלולריים לב. מוסיף מראים חוסר תאים של המערכת החיסונית של הלב השליטה נגוע עוף (השתנה מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות 3). איור 5. Chagas כמו קרדיומיופתיה דלקתית מורחבים ב צאצאים F2 עם שילוב kDNA בגן הדיסטרופין. א) לב מורחבים ב עוף 10 חודשים בן תופס את רוב חלל בית החזה (הלב משקל = 16 גרם). ב) כהים תאים עגולים mononuclear מחלחל והורס שריר הלב של חן kDNA-מוטציה. ג) לב בגודל רגיל (7 משקל גרם) של עוף 10 חודשים בת שליטה. D) היסטולוגיה רגילה של הלב עוף שליטה. (שונה מ PLoS חוג מוזנחתאל מחלות 3). איור 6. השוואתי פתולוגיה עוף kDNA מוטציה ועל המחלה Chagas האדם. א) קשה לב דלקת שריר הלב היעד lyses סלולריים עוף kDNA-מוטציה. ב) דלקת שריר הלב חמורה סלולריים lyses היעד על ידי לימפוציטים חיסון במקרה של מחלת לב Chagas. ג) דחיית לתאי לב על ידי לימפוציטים חיסוניים עוף kDNA-מוטציה. ד) דחיית לתאי לב על ידי לימפוציטים חיסוניים למחלות Chagas האדם. מוכתמת על ידי Hematoxilin ו Eosin. (שונה מ Memórias לעשות Instituto אוסבלדו קרוז, ריו דה ז'נרו 14).