Cine Cultura de la Seda del sistema para In vitro Análisis y Diseño de Biomateriales

1. Fabricación de moldes de caucho de silicona Producir o adquirir una superficie topográfica deseada para la fundición. Para esta publicación un estándar de 100 mm de la oblea de silicio grabada se ha descrito (Figura 1). Pesar polidimetilsiloxano (PDMS) encapsulamiento (componente A) y catalizador (componente B) solución en una relación 1:9 (9 g encapsulamiento y 1 g de catalizador) según lo dispuesto en el kit comprado. Mezcle las soluciones de fondo para iniciar el proceso de curado. Colocar oblea de silicio superficie dentro de un plato de colada. Pesar 4,5 g de solución de PDMS sobre obleas de silicio. Propagación PDMS solución como para cubrir un área de 100 mm de diámetro de la superficie de la oblea. Incline la oblea para difundir solución de PDMS de manera uniforme. Cubrir oblea con 100 mm de diámetro tapa placa de Petri. Lugar de fundición de instalación en estufa a 60 º C durante la noche, asegurándose de que el curado se lleva a cabo sobre una superficie plana. Colocar curado PDMS / obleas de silicio en 70% de etanolbaño antes de la eliminación. Comienza la eliminación de PDMS de obleas mediante el uso de hoja de afeitar para levantar el borde (circunferencia) en primer lugar. Tire suavemente de PDMS fuera de uso de fórceps en un baño de etanol al 70% teniendo cuidado de no romper la fundición de caucho de silicona. Rompa los moldes individuales con PDMS 14 perforadora mm. Este diámetro está diseñado para encajar en una configuración de placa de 24 pocillos. 2. La producción de solución de seda Llevar 2 L de agua destilada (dH 2 O) a ebullición dentro de un vaso de vidrio 7. Cortar 5 g de Bombyx mori capullos de seda en tres partes. Elimine los capullos ampliamente contaminados por insectos, como se indica exceso de recubrimiento de las partículas en la superficie del capullo interior. Medir 4,24 g de carbonato de sodio. Añadir carbonato de sodio lentamente hasta ebullición dH 2 O volumen para evitar que se desborde de agua, y permitir la completa disolución antes de continuar. Agregue los trozos de capullo hasta que hierva dH <sub> 2 O durante 40 min., y usar una barra de teflón recubierto revuelo para agitar capullos durante el proceso de ebullición. Después de hervir, escurrir con cuidado DH 2 O en el fregadero y el anillo de extracto de seda a mano para eliminar el exceso de agua. Lavar seda extraer tres veces durante 20 min. cada uno en 1 L de H 2 O en un vaso de precipitados de laboratorio, y utilizar una barra de agitación para hacer circular el volumen dentro de vaso de precipitados. Después de lavar, el anillo a cabo el extracto de seda a mano y el extracto de seda fibra lugar dentro de una campana química para permitir el secado de una hora 12. período. Al día siguiente, pesan las fibras de seda secas, que es típicamente ~ 3,5 g: ___________-g Preparar 9,3 solución LiBr M para un 20% w / v de seda. Utilizar siguientes ecuaciones para calcular el peso necesario y volúmenes: (Peso de la Seda extracto de la etapa 10) x (4) = ___________ ml de solución total de 9,3 M LiBr [(807.705) x (volumen de la parte LiBr 11.a)] / 1000 = ___________ g de LiBr para añadir a DH 2 O </ Li> Añadir peso medido LiBr en un vaso de vidrio de la siguiente volumen de DH 2 O: (0,8) x (volumen calculado a partir del paso 11.a) = ___________ ml de H 2 S Verter esta solución en un tamaño adecuado cilindro graduado, y llevar solución hasta el volumen final, calculado en la parte 11.a. Coloque el extracto de seda en el vaso y vierta la solución LiBr sobre las fibras de seda que hacen que las fibras de seda están inmersas en la solución LiBr con una espátula de laboratorio. Colocar la seda disuelto en 60 ° horno C durante 4 horas: Hora de inicio: ___________ Hora de finalización: ___________ Usando una jeringa de tamaño adecuado elaborar 12 ml de la solución de seda. Coloque una aguja 18G en el extremo de la jeringa, y luego inyectar la solución en un casette de diálisis (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Después de llenar la bandeja, sacar el aire que queda fuera de la cinta con la jeringa vacía. Lugar ficasete de diálisis lled el plazo de 1 L de H 2 O. Cambiar DH 2 de O después de 1 hora, 4 horas, de 8 horas y luego cada 12 horas 3 veces para un total de 6 cambios: Inicio: ___________ 1 hora: ___________ 4 horas para situaciones: ___________ 8 horas: ___________ 12 horas: ___________ 12 horas: ___________ 12 horas: ___________ Final: ___________ Después de la diálisis, lentamente recoger la solución de la seda de cassettes con la jeringa. Coloque la solución en tubos de centrífuga de 10.000 g nominales. Centrifugar la solución dos veces a 10.000 ga 4 ° C durante 20-minutos cada uno. Después de cada sobrenadante lugar centrifugación en un tubo nuevo. Tienda thr solución de seda en 4 ° C refrigerador. Pipeta 2 muestras de 0,5 ml de solución de seda en pequeños pesar la cápsula, y el lugar pesan los platos dentro de un horno a 60 ° C en seco durante 12 horas o hasta que se seque de seda de la solución. Pesar la película restante de seda sólido a partir de both muestras para medir solución de seda por ciento en peso de concentración en volumen de proteína: Peso de la combinación de 2 muestras de cine de seda: ___________ mg (Peso de la 23.a) x (100) = seda ___________% 3. Preparación de las películas de seda y de instalación de sistema de cultivo Prepare las superficies de PDMS de fundición de una limpieza con cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo. Limpieza PDMS sustratos por inmersión en el 70% de etanol y lavar tres veces con dH 2 O. Colocar 14 mm moldes PDMS en el plato de soporte, que es típicamente una tapa 24 y placa. Para producir una película de 50 micras de espesor, se extendió 70 μls de solución de seda 8% en moldes de PDMS utilizando una herramienta de propagación líquido que es típicamente un 1 ml jeringa con punta 2. Permitir las películas de seda para secar cubierto en un banco corriente limpia una presión de flujo de aire de 150 Pa durante un período de 90 minutos o hasta que las películas están secos. Una vez que las películas son un lugar seco todo el conjunto de películas, incluyendo PDMS medad, en una cámara de agua-recocido durante más de 4 horas para producir una película insoluble en agua. Esto es típicamente una cámara de vacío desecador con agua en el fondo de la cuenca tiró de un vacío kPa 25 15. Quite las películas de seda de agua la cámara de recocido y coloque en una mesa de trabajo limpia. Preparar un baño de EtOH 70% en un 35 mm placa de Petri, y sustratos lugar de control (es decir, vidrio o plástico) y anillos de acero inoxidable dentro de los pozos por lo menos durante 10 minutos para esterilizar. Quite las películas de seda a partir de moldes de PDMS con fórceps, a sumergirse en EtOH al 70%, y muestra el lugar en placa de 24 pocillos prellenada con 1 ml de EtOH al 70% haciendo que el lado estampado quede hacia arriba para permitir la adhesión celular. Después de colocar cada muestra de cine de seda en un lugar así correspondientes inoxidable pesos de acero del anillo (11,65 mm de diámetro interior, 15,45 mm de diámetro exterior y 1,18 mm de espesor) en la parte superior. Deje que las muestras con anillos de incubar durante 10 minutos para mantener la esterilidad. RemoVe EtOH y lavar cada muestra 3 veces con 1 ml de PBS. Que cada lavado reposar durante 5 min para permitir la difusión completa. Retire PBS utilizando una pipeta de aspiración de vidrio, mientras se asegura de eliminar la mayoría de las burbujas por debajo de las muestras de cine de seda. Preparar la línea celular para la siembra. Como un ejemplo, trypsinize humano corneal limbal-epitelial (HCLE) línea celular con 0,25% de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para solución de 7-min. Desactivar el uso de la tripsina 01:01 volumen de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), los medios de comunicación de paso con FBS al 10% añadido. Centrifugar las células con tripsina HCLE, añadir 8 ml de queratinocitos medio libre de suero (K-SFM) al pellet de células, agitar suavemente para dispersar HCLEs, y generar el recuento de células. Muestra de 500 l de la suspensión HCLE por pozo típicamente usando una de cada 10.000 células / cm 2 de la densidad. Coloque las culturas dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 y ejecutar el protocolo que desee experimental. 4. Los resultados representativos <clase p = "jove_content"> Figura 1. Flujograma que ilustra resumida proceso de 10 pasos de la producción de seda, el cine y la preparación del sistema de cultivo. Figura 2. (A) 21-colorante matriz de topografías superficiales estampadas línea producidas sobre una oblea de silicio de 90 mm ​​de diámetro empleando técnicas estándar de grabado fotolitográficas y seco. (B) las películas originales de seda conservan características de la línea en paralelo con dibujos después de la fundición de moldeo en las superficies de PDMS. (C) Esquema mostrando el diseño tamaño de la característica elegida para facilitar la alineación celular. (D) Sección transversal de la película de seda que ilustra retenido superficie paralela alineada con dibujos. Figura 3. Micrografías electrónicas de barrido de línea celular HCLE adherirse a (A) con patróny (B) las películas planas de seda en el día 2 en cultivo. Culturas HCLE siguen proliferando en la confluencia de (C) con dibujos y (D) las superficies planas el día 8 en la cultura. Figura 4. (A, D, G) con dibujos y (B, E, H) películas planas de seda de cultivo las células HCLE comparativamente a (C, F, I) sustratos de vidrio de control en (AC) el día 1, (DF) el día 4, y (GI) el día 8 en la cultura. (J) contenido CyQuant ácido nucleico y (K) (3 – (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) datos de la actividad metabólica de ensayo que demuestran la viabilidad HCLE tanto en estampado y planas sustratos de película de seda cuando se compara con las superficies de control de vidrio en el tiempo (barras de escala = 100 micras). Video 1. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie de película de estampado de seda durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. Haga clic aquí para ver la película . Video 2. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie plana de control de TCP durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. Haga clic aquí para ver la película .