Silk Film Culture-System für In-vitro- Analyse und Design-Biomaterial
概要
Silk Filme sind eine neue Klasse von Biomaterialien leicht anpassbar für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen. Das vorgestellte Seide Filmkultur System ist sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl von<em> In-vitro-</em> Analysen. Dieses System stellt eine Biomaterial-Design-Plattform-Angebot<em> In-vitro-</em> Optimierung, bevor direkte Übersetzung zu<em> In-vivo-</em> Modelle.
Abstract
Silk Filme sind vielversprechend Protein-basierten Biomaterialien, die mit hoher Wiedergabetreue und wirtschaftlich in einem Forschungslabor Umwelt 1,2 hergestellt werden können. Diese Materialien sind wünschenswert, da sie in hohem Maße steuerbar Abmessungen und Materialeigenschaften, besitzen, sind biokompatibel und zur Förderung der Zelladhäsion, durch topographische Muster oder durch chemische Veränderung der Oberfläche modifiziert werden, und kann als ein Depot für biologisch aktive Moleküle zur Arzneimittelabgabe Anwendungen verwendet werden 8.3. Darüber hinaus sind Filme Seide relativ einfach selbst zu gestalten, können entworfen, um innerhalb von Minuten auflösen oder zersetzen sich über Jahre in vitro oder in vivo werden und sind mit dem zusätzlichen Vorteil des Seins in der Natur transparent und daher sehr gut für Imaging-Anwendungen produzieren 9 – 13. Die Kultur hier vorgestellte System-Methodik stellt einen skalierbaren Ansatz für die schnelle Beurteilung der Zell-Seide FilmoberflächeWechselwirkungen. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von strukturierten Oberfläche Seidenfilme Unterschiede bei der Zellproliferation und Antworten von Zellen zur Ausrichtung 12,14 studieren. Gesetzt wurden die Kulturen sowohl auf mikro-strukturierten und flachen Substraten Seide Film kultiviert und dann beurteilt durch Zeitraffer-Phasen-Kontrast-Bildgebung, Rasterelektronenmikroskopie, und biochemische Beurteilung der metabolischen Aktivität und Nukleinsäure-Inhalte. Zusammenfassend bietet die Seide Film in vitro-Kultur-System eine anpassbare Versuchsaufbau geeignet zur Untersuchung von Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen auf einem Biomaterial Substrat, die dann optimiert und anschließend übersetzt werden kann, um in-vivo-Modellen. Beobachtungen mit dem Kultur hier vorgestellte System werden derzeit verwendet werden, um in Anwendungen, die von grundlegenden Zell-Interaktionen auf Design medizinischer Geräte zu unterstützen, und somit relevant sind eine breite Palette von biomedizinischen Bereichen.
Protocol
Discussion
Die Verwendung von Seide regeneriert Filme als Substrat für die Zellkultur hat in der Popularität in den letzten zwei Jahrzehnten durch umfassende Charakterisierung der Werkstoffeigenschaften dieses Proteins gewonnen und erhöht das Verständnis seiner Biomaterial Dienstprogramm 3,8. Die Kultur hier beschriebene System stellt einen neuartigen In-vitro-Testsystem für die Beurteilung der Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen auf gemusterter Seide Film Biomaterial Substrate 7. Das System ermöglicht eine gründliche Analyse der zellulären Interaktionen im Laufe der Zeit, die leicht für High-Throughput-Datenerhebung angenommen werden kann. Dies ist weitgehend aktiviert, da Seidenfilme eine Reihe von abstimmbaren Biomaterial-Eigenschaften, die modifiziert werden, um unmittelbar auf die Zellfunktion 8,9,12 werden können, einschließlich besitzen: Kontrolle der oberflächlichen / nano-Oberflächentopographie 7; verschiedenen Oberflächenchemie durch kovalente Modifikation oder Adsorption von biologisch aktiven Molekülen 13; robust mechanisch Eigenschaften 15,16; Kontrolle von Material Hydrophilie / Hydrophobie 16; Bulkbeladung von biologischen Verbindungen zur Freigabe 4,8,17; und kontrollierte Auflösung / enzymatischen Abbauraten durch die Kontrolle der Sekundärstruktur (Beta-Faltblatt-Gehalt) 11,18,19 .
Die Transparenz der Seide Filme wird durch Tempern der Filme für einen Zeitraum unter Vakuum in Gegenwart von Wasserdampf 7,15 erreicht. Dieser Ansatz ermöglicht die Verarbeitung für die Bildung von β-Faltblatt-Sekundärstruktur, die Förderung der Unlöslichkeit des Materials in Wasser und ermöglicht minimale Beugung des Lichts 15. Diese Transparenz der Filme ist der Schlüssel in die eine direkte Bildgebung lebender Zellen, die unter einer Reihe von bildgebenden Verfahren (zB Weitwinkel-und Fluoreszenz) mit einer beliebigen Anzahl von Mikroskop-Systeme 12,20 eingesetzt werden können. Neben Live-Cell-Imaging, kann Seide Filme leicht von th entfernt werdenE-Kultursystem für zusätzliche Fixierung und Analyse zu ermöglichen. Somit sind die Vielzahl von direkten experimentellen Untersuchungen, die auf diesem System ausgeführt werden können, anwendbar auf eine Vielzahl von Zellen / Gewebe Quellen für die vielen technischen Bereichen 3,8,9,12,13,21. Die Zeitraffer-Imaging-Ergebnisse zeigen, wie Echtzeit-Kultur Daten gesammelt werden können, und als ein Beispiel verwendet wurden, um darzustellen, wie Oberflächentopographie Zell-Interaktionen beeinflusst. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie Seide Film Biomaterialien verwendet werden können, um HCLE Kulturwachstum zu unterstützen, und änderbare einer Reihe von Standard-Zellproliferation und metabolische Assays (4). Darüber hinaus werden die Kulturen fixiert und für die REM-Bildgebung oder anderen Protokollen (Abb. 3).
Silk Film Substrate werden im Labor mit hoher Genauigkeit, Konsistenz hergestellt, und mit relativ geringen Kosten (Abb. 1). Dies ermöglicht Reproduzierbarkeitkeit sowohl in Kultur das System-Setup und experimentellen Ergebnissen. Es hat sich gezeigt, dass Wasser-Glühen Verarbeitung eine stabile Seide Filmmaterial in der Kultur, die Abbauraten definiert wurde bis zur Konzentration von Proteasen in Lösung 2,15,22 produziert. Als Folge können diese Materialien für längere Zeit für eine langfristige Zellkulturen verwendet werden, oder bleiben für Monate oder Jahre in Abhängigkeit von der physiologischen Lage 8 implantiert. Darüber hinaus haben neuere Arbeiten gezeigt, dass sowohl die Protein-Struktur und Materialeigenschaften von Wasser-geglüht Seide Filme konsistent von Charge zu Charge ermöglicht für reproduzierbare Ergebnisse als Kultur durch verschiedene mechanische und biophysikalische Testmethoden 15,16 dargestellt sind. Darüber hinaus hat der Oberfläche des Materials großer Treue unter Chargen Film gezeigt, wie durch SEM, atomic force micrscopy (AFM), und Untersuchungen an Zellkulturen {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} angegeben 7,23,24. Material stabilITY und Konsistenz ist ein wichtiger Faktor dafür, wie die Zelle die Kultur Substrates durch die verschiedenen Wege Mechanotransduktion zu erfassen, und schließlich ein gewünschter / unerwünschte zelluläre Antwort 25,26.
Historische Standards für Kultur Substrate wie Gewebekultur behandelt Kunststoff oder Glas, für ausreichende Substrate für Zelladhäsion. Allerdings sind diese Materialien nicht für weitere in-vivo-Dienstprogramm geändert werden könnte. Es sollten daher durch ein seidenes Film Biomaterial in vitro konnte den Kundenwünschen angepasst werden, und einmal experimentellen Erwartungen erreicht wurden, die maßgeschneiderte Film kann direkt an ein in vivo Modell übersetzt werden. Solche Design gepaart zwischen in vitro und in vivo Experimenten bietet einen großen Vorteil für derartige implantierbare Biomaterialien Seide über andere Substrate, die routinemäßig in vitro verwendet werden.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung von NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 und R01 EY020856 Forschung zur Erblindung Career Development Award, und Tri-Institutional Stem Cell Initiative verhindern. HCLE Zelllinie zur Verfügung gestellt mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ilene Gipson. Die Autoren danken Herrn Dr. Aihong Liu am Weill Cornell Medical College danken für ihre technische Unterstützung und Beratung mit Zellkultur, Anthony Labissiere am Hospital for Special Chirurgie für ihre technische Unterstützung mit SEM Bildgebung, das Tissue Engineering Resource Center (TERC) bei Tufts University für die technische Unterstützung bei der Materialentwicklung und der Cornell Center for Nanoscale Science and Technology Facility (CNF) um Unterstützung bei der Herstellung von Siliziumwafern.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number |
| Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
| PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
| Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
| Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
| Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
| 1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
| Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
| 24-well plate | VWR | 353047 |
参考文献
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