Silk Film Culture-systeem voor In vitro Analyse en biomateriaal Ontwerp

1. Fabricage van Siliconen Rubber Mallen Maak of koop een gewenste topografische ondergrond voor het gieten. Voor deze publicatie een standaard 100 mm geëtst siliciumplak wordt beschreven (figuur 1). Weeg polydimethylsiloxaan (PDMS) oppotten (component A) en katalysator (component B) oplossing in een 1:9 verhouding (9 g potgrond en 1 g katalysator), zoals bepaald in de gekochte kit. Meng oplossingen voor uitharding proces te starten. Plaats silicium oppervlak van een wafer binnen een casting schotel. Weeg 4,5 g van PDMS oplossing op silicium wafer. Spread PDMS oplossing aan 100 mm diameter gebied van de wafer oppervlak. Kantel wafer te PDMS oplossing gelijkmatig te verspreiden. Bedek wafer met diameter van 100 mm petrischaal deksel. Plaats gieten setup in 60 ° C oven gedurende de nacht, waardoor er zeker van dat uitharding plaatsvindt op een vlakke ondergrond. Plaats genezen PDMS / silicium wafer in 70% ethanolbad voor de verwijdering. Beginnen met het verwijderen van PDMS wafer door gebruik te maken scheermesje naar de rand van (gehele omtrek) eerst op te heffen. Trek voorzichtig PDMS uit met pincet binnen een 70% ethanol bad zorg dat u siliconenrubber gieten scheuren. Punch Out individuele PDMS vormen met behulp van 14 mm perforator. Deze diameter is ontworpen om te passen in een 24-wells plaat setup. 2. De productie van zijde oplossing Breng 2 liter gedestilleerd water (dH 2 O) aan de kook in een glazen beker 7. Snijd 5 g van Bombyx mori zijderups cocons in drieën. Gooi uitgebreid besmet cocons, zoals aangegeven door een te grote insecten deeltjes het bekleden van het inwendige cocon oppervlak. Meet 4,24 g natriumcarbonaat. Voeg langzaam natriumcarbonaat tot het kookpunt dH 2 O volume om over te koken van water te voorkomen, en laat het volledig is opgelost voordat u verder gaat. Voeg cocon stukken aan de kook dH <sub> 2 O voor 40 minuten., en gebruik een teflon bekleed roerstaafje om cocons roeren tijdens het koken proces. Na het koken goed uitlekken dH 2 O in de gootsteen en de ring uit de zijde-extract met de hand om het overtollige water te verwijderen. Was zijde driemaal extract gedurende 20 minuten. elk in 1 L van dH 2 O in een lab beker, en gebruik een roervlo om het volume te circuleren binnen de beker. Na het wassen, ring uit de zijde-extract met de hand en plaats zijde fiber-extract in een chemische kap mogelijk te maken voor het drogen voor een 12 uur. periode. De volgende dag, wegen de gedroogde zijde vezels, die typisch is ~ 3,5 g: ___________-g Bereid 9,3 M LiBr oplossing voor een 20% w / v oplossing van zijde. Gebruik volgende vergelijkingen de nodige gewicht en volumes te berekenen: (Silk-extract gewicht van stap 10) x (4) = ___________-mL van het totaal 9,3 M LiBr oplossing [(807.705) x (LiBr volume van deel 11, A)] / 1000 = ___________ g LiBr toe te voegen aan dH 2 O </Li> Voeg gemeten LiBr gewicht in een glazen beker van de volgende dH 2 O volume: (0,8) x (berekende volume van stap 11, A) = ___________ ml dH 2 O Giet deze oplossing in een geschikt formaat maatcilinder, en Breng de oplossing tot aan de uiteindelijke volume, zoals berekend in het kader 11.a. Plaats de zijde-extract in de beker en giet LiBr oplossing over de zijdevezels zorg ervoor dat de zijde vezels worden ondergedompeld in LiBr oplossing met behulp van een lab spatel. Plaats de opgeloste zijde in 60 ° C oven gedurende 4 uur: Start tijd: ___________ Eindtijd: ___________ Met behulp van een geschikte grootte spuit het opstellen van 12 ml van de zijde oplossing. Plaats een 18G naald op het einde van de spuit, en vervolgens de oplossing te injecteren in een dialyse cassette (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Na het vullen van de cassette, trekken de resterende lucht uit de cassette met de lege spuit. Plaats filled dialyse cassette binnen 1 L van DH 2 O. Wijzig dH 2 O volume na 1 uur, 4 uur, 8 uur en vervolgens om 12 uur 3x voor een totaal van 6 veranderingen: Begin: ___________ 1 uur: ___________ 4HR: ___________ 8 uur: ___________ 12 uur: ___________ 12 uur: ___________ 12 uur: ___________ Einde: ___________ Na dialyse, langzaam het verzamelen van de zijde oplossing van cassettes met een spuit. Plaats oplossing in 10.000 g beoordeeld centrifugebuizen. Centrifugeer tweemaal de oplossing bij 10.000 g bij 4 ° C gedurende 20 min elk. Na elke centrifugeren plaats supernatant in een nieuwe buis. Store THR zijde oplossing in 4 ° C koelkast. Pipetteer 2 monsters van 0,5 ml zijde oplossing in kleine wegen schotel, en plaats af te wegen gerechten in een 60 ° C droge oven gedurende 12 uur of totdat de zijde oplossing droogt. Weeg het resterende vaste zijde film uit both monsters zijde oplossing procent gewicht te meten om het volume te eiwitconcentratie: Gewicht van de gecombineerde 2 zijde film monsters: ___________ mg (Gewicht van 23.A) x (100) = ___________% zijde 3. Voorbereiding van Silk Films en Cultuur System Setup Bereid PDMS casting oppervlakken door reiniging met doorzichtige tape om stof te verwijderen. Schoon PDMS substraten door het weken in 70% EtOH en was drie keer met dH 2 O. Plaats 14 mm PDMS mallen op houder plaat, die typisch is een 24-wells plaat deksel. Om een 50 micrometer dikke film te produceren, 70 μls van 8% zijde oplossing verspreid over PDMS mallen met behulp van een vloeistof verspreiden instrument dat typisch is een 1 ml spuit 2. Laat de zijde films te drogen onbedekt een schone bank waarop een luchtstroom druk van 150 Pa gedurende 90 min of tot films droog. Zodra films zijn droge plaats geheel van de films, waaronder PDMS moud, in een water-annealen kamer voor> 4 uur aan een in water onoplosbare folie. Dit is typisch een lege kamer exsiccator met water in de bodem van het bassin getrokken in een 25 kPa vacuüm 15. Verwijder de zijde films uit het water-gloeien kamer en plaats op een schone bank. Bereid een 70% EtOH bad binnen een 35 mm petrischaaltje, en plaats controle substraten (dat wil zeggen glas of plastic oppervlakken) en roestvrij stalen ringen in putten voor ten minste 10 minuten te steriliseren. Verwijder de zijde films uit PDMS mallen met behulp van een tang, dompel ze in 70% EtOH, en plaats monster in 24-wells plaat ingevuld met 1 ml van 70% EtOH ervoor te zorgen bedrukte zijde naar boven gericht is om voor celadhesie. Na het plaatsen van elke zijde film monster in een overeenkomstige goed plaats roestvrij stalen ring gewichten (11,65 mm binnendiameter, 15.45 mm buitendiameter, en 1,18 mm dikte) op de top. Laat monsters met ringen om incubeer gedurende 10 minuten om de steriliteit te garanderen. Remove EtOH en was elk monster 3x met 1 ml PBS. Laat elke wasbeurt zitten voor 5 minuten om te zorgen voor volledige diffusie. Verwijder PBS met behulp van glazen pipet opzuigen, terwijl zorg ervoor dat meerderheid van de luchtbellen te verwijderen onder zijde film monsters. Bereid cellijn voor het zaaien. Als voorbeeld trypsinize menselijke cornea-limbale epitheel (HCLE) cellijn met 0,25% trypsine en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing van 7 min. Schakel trypsine met behulp van 01:01 volume van Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) passage media met 10% FBS toegevoegd. Centrifugeer getrypsiniseerd HCLE cellen, voeg 8-ml keratinocyt serum vrije media (K-SFM) naar celpellet, zachtjes schudden om HCLEs verspreiden, en het genereren van cellen. Voorbeeld 500 pi van HCLE schorsing per putje meestal met behulp van een 10.000 cellen / cm 2 dichtheid. Plaats culturen binnen incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 en voer de gewenste experimentele protocol. 4. Representatieve resultaten <p class = "jove_content"> Figuur 1. Stroomschema illustreren verkorte 10-stap-proces van zijde filmproductie en cultuur systeem voorbereiding. Figuur 2. (A) 21-dye reeks patroon lijn oppervlak topografieën geproduceerd op een diameter van 90 mm ​​silicium wafer in dienst standaard fotolithografische en droge etstechnieken. (B) Silk films bewaart de originele parallelle lijn patroon functies na het gieten op PDMS vormen van oppervlakken. (C) Schematische tonen feature size ontwerp gekozen om cellulaire afstemming te bevorderen. (D) Doorsnede van zijde film illustreren behouden parallel gevoerd patroon oppervlak. Figuur 3. Rasterelektronenmicrografieën van HCLE cellijn vast te houden aan (A) patroonen (B) vlakke zijde films op dag 2 in cultuur. HCLE culturen blijven woekeren tot confluentie op (C) patronen en (D) vlakke oppervlakken op dag 8 in cultuur. Figuur 4. (A, D, G) met patroon en (B, E, H) vlakke zijde films cultuur HCLE cellen hoger dan bij (C, F, I) glas controle substraten bij (AC) dag 1, (DF) dag 4, en (GI) dag 8 in de cultuur. (J) CyQuant nucleïnezuur inhoud en (K) (3 – (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide (MTT) metabolisme assay gegevens blijkt HCLE levensvatbaarheid van zowel patroon en vlakke zijde filmsubstraten in vergelijking met glas stuurvlakken in de tijd (schaalbalken = 100 pm). Video 1. Time lapse fase-contrast beeldvorming van HCLE cellen migreren over een patroon zijde film oppervlak tijdens een 18 uur. periode. Cellen werden gezaaid op 10k/cm 2 dichtheid en gekweekt gedurende 2 uur. voor de beeldvorming. Klik hier om de film te bekijken . Video 2. Time lapse fase-contrast beeldvorming van HCLE cellen migreren over een vlakke TCP controle-oppervlak tijdens een 18 uur. periode. Cellen werden gezaaid op 10k/cm 2 dichtheid en gekweekt gedurende 2 uur. voor de beeldvorming. Klik hier om de film te bekijken .