Filmes de seda são uma nova classe de biomateriais facilmente personalizáveis para uma vasta gama de aplicações biomédicas. O sistema de cultura de seda apresentado filme é altamente adaptável a uma variedade de<em> In vitro</em> Análises. Este sistema representa uma oferta de plataforma biomaterial projeto<em> In vitro</em> Otimização antes de tradução direta para<em> In vivo</em> Modelos.
Películas de seda são promissores proteína à base de biomateriais que podem ser fabricadas com alta fidelidade e economicamente dentro de um ambiente de investigação 1,2 laboratório. Estes materiais são desejáveis porque possuem altamente controlável características dimensionais e material, são biocompatíveis e promover a adesão celular, pode ser modificado através de padronização topográfica ou pela alteração química de superfície, e pode ser usado como um depósito para as moléculas biologicamente activas para aplicações de entrega de drogas relacionados 3-8. Além disso, as películas de seda são relativamente simples de design personalizado, pode ser concebido para dissolver dentro de minutos ou degradar ao longo do ano, in vitro ou で vivo, e são produzir com o benefício adicional de ser transparente na natureza e, portanto, altamente adequado para aplicações de imagiologia 9 – 13. A metodologia de sistema de cultura aqui apresentada representa uma abordagem escalável para avaliações rápidas de células-seda superfície do filmeinterações. De particular interesse é a utilização de películas de superfície de seda estampados para estudar as diferenças na proliferação celular e respostas das células para o alinhamento 12,14. As culturas semeadas foram cultivadas em dois micro-padronizado e substratos filme plano de seda, e, em seguida, avaliados através de lapso de tempo de imagens de contraste de fase, microscopia eletrônica de varredura e avaliação bioquímica da atividade metabólica e teor de ácido nucléico. Em resumo, o filme de seda sistema in vitro de cultura oferece uma configuração customizável experimental adequado para o estudo da superfície celular interacções sobre um substrato biomaterial, que podem então ser optimizadas e, em seguida, traduzido a modelos で vivo. Observações utilizando o sistema de cultura aqui apresentados estão actualmente a ser utilizada para auxiliar em aplicações que variam de interacções de células básicas para concepção de dispositivos médicos, e, portanto, são relevantes para uma ampla gama de campos biomédicas.
A utilização de películas de seda regeneradas como um substrato para a cultura de células ganhou em popularidade ao longo das duas últimas décadas, devido à extensa caracterização das propriedades do material desta proteína e aumento da compreensão da sua utilidade biomaterial 3,8. O sistema de cultura descrito aqui representa um novo sistema de testes in vitro para avaliar as interações de superfície celular em seda estampados filme biomaterial substratos 7. O sistema permite a análise em profundidade das interações celulares ao longo do tempo que podem ser facilmente adotados para alto rendimento de coleta de dados. Isto é largamente activado porque os filmes de seda possuir um número de propriedades sintonizáveis biomaterial que pode ser modificada para afectar directamente a função da célula 8,9,12, incluindo: controlo de superfície micro / nano-topografia de superfície 7; químicas de superfície diferentes através da modificação covalente ou adsorção de moléculas biologicamente ativas 13; mech robustapropriedades anical 15,16, controle da hidrofilicidade material / hidrofobicidade 16; carregamento em massa de compostos biológicos para a liberação 4,8,17, e de dissolução controlada / taxas de degradação enzimática através do controle da estrutura secundária (conteúdo folha beta) 11,18,19 .
A transparência de filmes de seda é conseguido através de recozimento dos filmes por um período de tempo sob vácuo na presença de vapor de água 7,15. Esta abordagem permite o processamento para a formação de folhas β estrutura secundária, promovendo a insolubilidade do material em água, permitindo simultaneamente difracção mínima de luz 15. Essa transparência de filmes é fundamental para permitir que imagens ao vivo direto de célula que pode ser contratado com um número de modalidades de imagem (ou seja, de campo amplo e fluorescência) usando qualquer número de sistemas de microscópio 12,20. Além vivo de células de imagem, os filmes de seda pode ser facilmente removido do thsistema de cultura e para permitir a fixação adicional e análise. Assim, a grande variedade de directos avaliações experimentais que podem ser realizados neste sistema são aplicáveis a uma grande variedade de células / tecido fontes para muitos campos técnicos 3,8,9,12,13,21. Os resultados lapso de tempo de imagens ilustram como os dados em tempo real de cultura podem ser recolhidos, e como exemplo, foram utilizadas para ilustrar como topografia da superfície afeta as interações celulares. Os resultados representativos demonstram como biomateriais filme de seda podem ser utilizadas para suportar o crescimento da cultura HCLE, e são alteráveis a um número de proliferação celular padrão e ensaios de metabólicas (Fig. 4). Além disso, as culturas são fixadas e processadas para digitalização de imagens de electrões ou outros protocolos (Fig. 3).
Substratos filme de seda são produzidas no laboratório com alta fidelidade, a consistência, e com um custo relativamente baixo (Fig. 1). Isto permite reprodutibilidadedade, tanto na configuração do sistema de cultura e os resultados experimentais. Tem sido demonstrado que a água-anneal processamento produz um material de película estável dentro da cultura de seda que tem definido taxas de degradação enquanto se aguarda a concentração de proteases em solução 2,15,22. Como resultado, estes materiais podem ser usados durante períodos de tempo prolongados para a longo prazo de cultura de células, ou permanecer implantado por meses ou anos, dependendo da localização fisiológica 8. Além disso, trabalhos recentes demonstraram que tanto a estrutura da proteína e as propriedades do material de filmes água-recozido de seda são consistentes de lote para lote permitindo resultados da cultura reprodutíveis como mostrado através de vários métodos de ensaio mecânicas e biofísica 15,16. Além disso, a superfície do material mostrou grande fidelidade entre lotes de película, tal como indicado por SEM, de força atómica micrscopy (AFM), e os estudos de cultura de células {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 7,23,24} 2011kq. Stabil materialdade e consistência é um fator importante a forma como a célula irá sentir o substrato de cultivo através das vias mecanotransdução vários, e, finalmente, produzir uma resposta desejada / não desejada celular 25,26.
Normas históricos para substratos de cultura, tais como o plástico de cultura de tecidos tratados ou de vidro, proporcionar substratos adequados para ligação celular. No entanto, estes materiais não são alteráveis para a utilidade adicional in vivo. Pode ser previsto que um filme de seda biomaterial pode ser personalizado in vitro, e uma vez expectativas experimentais foram realizados a película personalizado pode ser directamente convertido para um modelo で vivo. Desenho emparelhado tais entre in vitro e で vivo experimentação oferece uma grande vantagem para tais biomateriais de seda implantáveis mais de outros substratos que são rotineiramente usados in vitro.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento do NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 e R01 Pesquisa EY020856 para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira, e Tri-Institucional Iniciativa Stem Cell. Linha celular HCLE uma cortesia da Dr. Ilene Gipson. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Liu Aihong do Weill Cornell Medical College por sua assistência e orientação técnica com cultura de células, Anthony Labissiere no Hospital de Cirurgias Especiais para a assistência técnica com imagens SEM, a Engenharia de Tecidos Resource Center (TERC) em Tufts University para suporte técnico com o desenvolvimento material, e do Centro Cornell de Nanociência e Tecnologia Facility (CNF) para a assistência na fabricação de wafer de silício.
Material Name | Company | Catalogue Number |
Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
24-well plate | VWR | 353047 |