Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

1. 낮은 오염 배경의 작성 50 ML의 원심 분리기 튜브에 – 폴리 (히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트) (pHEMA) (세포 배양 검사 시그마)의 2g를 무게. 95 %의 50 ML (V / V) 물에 에탄올에 용해. 이것은 일반적으로 sonication 24 시간이 걸립니다. pHEMA 솔루션과 수영 코트 에폭시 – 기능성 유리 슬라이드 (Genetix). 에폭시 그룹은 빠르게 pHEMA 코팅과 공유 결합 관계를 형성합니다. 딥 코팅은 핀셋으로 유리 슬라이드를 개최하고 솔루션에 슬라이드를 찍어 의해 달성된다. 슬라이드 일반적으로 5mm가 슬라이드를 orientating하는 데 유용합니다 또한 준수 표면과 같은 긍정적 인 제어 역할을 할 수있는 코팅 남아 있습니다. 슬라이드 그런 다음, 1 s의 동안 pHEMA 솔루션에서 인출 반전과 슬라이드 홀더에 놓기 전에 10 분에 가까운 수평 위치에 건조 남아 있습니다. pHEMA 코팅 슬라이드 그런 다음 t의 전체 증발 할 수 있도록 1 주일 대기 상태에 남아 있습니다그는 용매. 2. 단량체 솔루션의 준비 photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-페닐 아세토 페논의 120 밀리그램 무게와 4 % (w / V) photoinitiator 솔루션을 만들기 위해 dimethylformamide (DMF) 3 ML에 추가 할 수 있습니다. 이것은 가장 각 인쇄를 실행하기 전에 신선한 완료, 질량과 한 솔루션의 볼륨 photoinitiator 솔루션이 필요합니다 얼마나 많은에 맞게 다양 할 수 있도록. 이 솔루션은 최대 한 달 안정적이다. 모노머 솔루션은 깔끔한 단량체의 3 부분 photoinitiator 솔루션의 한 부분을 추가하여 만들어집니다. 이것은 384도 소스 판에 photoinitiator 솔루션과 모노머의 15 μL의 5 μL를 pipetting에 의해 달성된다. 20 μL의 총 볼륨은 부분 형성에 이상적입니다. 높은 볼륨 균일 한 반점이 생성되기 전에 추가 blotting이 필요합니다. 작은 볼륨 핀의 불완전 로딩 될 수 있습니다. 이 방법은 현재 누나의 DMF에 용해 아르 아크릴 레이트 / 메타 크릴 레이트 단량체의 사용으로 제한됩니다이러한 탐구 한 유일한 조합되는의 rtue, acrylamides 및 기타 용매는 인쇄 프로세스 의무가 될 가능성이 있습니다. 낮은 단량체 농도는 고체 단량체에 사용할 수 있지만 단량체 농도가, 액체 단량체도 필요합니다 (75 % w / w) 제안 달성하기 위해 (감소 모노머 농도는이다 그러나 부정적인 결과 폴리머의 표면 화학을 변경하지 않는 것 같습니다 ) 분자 무게와 유리 전이 온도이 변경 가능성이 높습니다. 높은 휘발성 단량체는 polymerising 때 UV 경화 단계 이전에 의한 모노머의 급속한 증발로 사용하기 어렵습니다. 실행이 오래 6시간로하고 실행 휘발성 단량체의 끝 부분 소요될 수 있습니다 모노머 솔루션의 수에 따라 소스 접시에서 증발 한 것입니다. 휘발성 단량체의 사용은 인쇄 단계를 냉각 및 단기 인쇄 만 실행을 사용하여 달성 될 수있다. 몇 높은 친수성 ​​단량체를 제외하고제외하지 않습니다 있지만, 이러한 폴리 (에틸렌 글리콜) 아크릴 레이트, 수성 버퍼에 결과 폴리머 장소의 해산은 따라서 관찰되지 않았기 때문에, crosslinking의 모노머의 사용은 필요하지 않습니다. 3. 폴리머 microarray 형성 폴리머 microarray 형성을위한 일반적인 절차는 그림 1에 개략적으로 그려져 있습니다. Microarray 형성은 XYZ 단계 (그림 2)를 사용하여 연락처 로봇 (Biodot)를 사용하여 달성된다. 220 μm 직경의 홈 붙이 핀 (Arrayit 96B)를 사용하고 있습니다. 모든 핀은 인쇄 실행하려면 이전과 마찬가지로 핀 홀더도 청소해야 10 분에 dichloromethane에서 sonication하여 청소해야합니다. 핀은 blotting과 배열 슬라이드가로드 된 다음 전체 챔버가 산소에 의해 중합 래디칼의 담금질을 피하기 위해 충분히 낮은 2,000 ppm으로, 아래로 산소 수준을 줄이기 위해 아르곤로 가득, 홀더에로드됩니다. 습도가 maintaine입니다30-40% 사이에서 D. 습도를 포함하면 pHEMA 레이어를 침투하고 물리적 표면 2 속은가되기 위해 형성된 고분자을 허용 팽창하는 pHEMA 할 수 있습니다. 인쇄 실행이 시작됩니다. 각 운영 구성되어 있습니다 : 소스 접시에서 샘플을로드하는 중입니다. 핀 2.5 s에 대한 솔루션에서 개최 25mm / s의 속도에서 솔루션으로 낮아 후 25mm / s의 (그림 2)의 속도로 취소합니다. 핀은 핀의 외부에서 모노머 솔루션을 제거하려면 인쇄하기 전에 blotted해야합니다. 그 후 단량체 배달 일관 스폿 형성을 달성하기 위해 핀의 quilled 부분에서 발생합니다. 사용 blotting 시퀀스는 깨끗한 유리 슬라이드 33 연락처로 구성되어 있습니다. 처음 네 위치의 한 연락처 번호는 10, 5, 4, 각각 3. 다음 네 지점이 주소가 만들어집니다하며 마지막 3 위치에 1 개의 연락처가 이루어집니다. 각 연락처에 대한 총 접촉 시간은 10 밀리 접근 방법과 인출 속도가 175입니다mm / s의. 이 지점에 의해 형성되는 곳은 일관된 모양과 형상이 있어야합니다. 이 시점에서 실패 모노머 솔루션의 부정 핀이나 먼지 오염 물질을 나타냅니다. 단량체 솔루션은 다음 pHEMA 코팅 유리 슬라이드 (그림 2)에 인쇄됩니다. 한 개의 연락처를 175mm / s의 핀 운동에 장소에 따라 만들어 모노머 솔루션의 점도와 표면 에너지에 따라하면 400 μm의 평균 스폿 직경을 제공합니다 10 밀리의 시간을 문의합니다. 일반적으로 세 복제 배열은 각 유리 슬라이드에 인쇄되어 10 슬라이드의 총은 단일 실행에 인쇄되어 있습니다. 이 사이클 30 곳으로 equates. 핀은 DMF에 세척되어 있습니다. 신선한 DMF 2.5 L은 전체 세탁 실행을 위해 제공됩니다. 핀은 교반과 유동 욕조에 씻어 수 있습니다. 세척과 동시에, 갓 인쇄 된 슬라이드 30을 지속 세탁 기간의 기간 동안 30 MV / cm 2의 밀도에서 단파 UV (365 nm 정도) 소스와 방사선 있습니다. fter 모든 단량체 솔루션은 어레이가 추가 10 분 동안 UV (365 nm 정도)에 방사선 아르 인쇄됩니다. 갓 인쇄 된 배열 unpolymerized의 모노머와 용매를 제거하는 1 주일 낮은 압력 (<50 mTorr)에서 유지됩니다. 4. 높은 처리량 표면 특성 (HTSC) HTSC 기술의 일반적인 구조는 그림 3에 표시됩니다. 자동화, 높은 처리량 접근 방식에 대한 중앙의 특성화 장치와 폴리머 microarray의 정렬입니다. 모든 경우에있어서 이것은 배열의 최고 전망을 제공하는 카메라를 사용하여 달성된다. 처음에는 배열은 무대의 XY 운동에 부합하는 회전입니다. 배열의 코너 지점 그런 다음 자리 잡고 있으며 특정 좌표를 지정되어 있습니다. 각 폴리머 곳의 위치는 다음 배열의 크기를 사용하여 예측 할 수 있습니다. 물 접촉 각도 (WCA) 측정 WCA 측정에 고착의 드롭 방법을 사용하여 이동합니다자동 Krüss DSA 100 악기. ~ 400 PL의 볼륨과 하나의 물 방울은 각 폴리머 장소에 압전 구동 프린트 헤드를 사용하여 투여합니다. 폴리머 곳의 직경은 일반적으로 300 μm 일반적으로 100 μm이며, 따라서 하나의 측정은 고분자 장소에 따라 획득 할 수있는 폴리머 자리에서 물 비말의 기본 직경입니다. XY 스테이지는 인쇄 헤드 7 아래의 각 고분자 영역의 자동 위치 할 수 있습니다. 이것은 배열의 평면도를 제공하는 샘플 위에있는 카메라를 사용하여 달성된다. 처음에는 카메라 위치가 카메라 뷰의 중심에 물 비말의 분배를 정렬하기 위해 조정해야합니다 다음 배열은 인쇄 헤드로 정렬 할 수 있습니다. 고속 카메라가 표면을 타격하고 이후 증발시 물방울의 측면 프로필을 기록합니다. 드롭의 초기 영향을 캡처 프레임은 연락처 각도를 측정하는 데 사용됩니다. 원이 드롭 profi에 장착되어 있습니다르와 접촉 각도는 이후 결정. 시간의 기내 차 이온 질량 분석법 (ToF – 심스) 샘플을 무대로로드됩니다. 이 먼저 요금 보상을하는 데 도움이 깨끗 알 호일있는 무대를 기다리는 한 후 금속 나사 탭을 사용하여 위치에 슬라이드를 개최하는 것입니다. 샘플 단계는 ToF – 심스의 전송 챔버에 배치하고 1.6 × 10 -6 mbar 때까지 펌프 할 수 있습니다. 예제는 다음 일반적으로 1.0 × 10 -8 mbar의 진공 압력이 주요 분석 챔버로 전송됩니다. ToF – 심스 측정은 monoisotopic 이중 3 + "오므라 모드"25 KV에서 운영하는 주요 이온 소스를 사용하여 운영 ION-ToF IV 장비를 사용하여 실시하고 있습니다. 펄스 한 PA 차 이온 빔은 10 초 동안 microarray의 각 폴리머 곳의 100 × 100 μm 영역에서 수집 긍정적이고 부정적인 두 이차 이온과 분석 영역 rastered 수 있습니다ond 획득 시간. 이온 질량은 정확한 질량 지정을 허용하는 고해상도 시간의 기내 분석기를 사용하여 결정됩니다. 일반 대중 해상도 (m / Z 41)는 6000 끝났다. 낮은 에너지 전자가 (20 EV) 절연 표면 8 긍정적으로 청구 차 이온 빔에 의한 표면 충전을 보상하는 데 사용되었습니다. 원자 힘 현미경 (AFM) 자동화 된 단계가있는 대형 무대 AFM은 유리 슬라이드의 배열을 분석 필요합니다. 특성 항목 또는 ICON 현미경이 목적을 위해 이상적입니다. 샘플은 스테이지에 배치되어 무대의 위치가 배열의 오른쪽 상단 모서리에 홈으로합니다. 배열의 왼쪽 하단 모서리의 위치가 발견되는데,이 다른 모든 곳의 위치를​​ 보정 할 수 있습니다. 위치 목록이 생성 소프트웨어의 자동 샘플링 기능으로 공급된다. AFM 측정 모드를 활용에 Nanoscope 3000A 악기를 사용하여 이동합니다5. 약 300 kHz에서의 공진 주파수 40 N / m의 일정한 힘으로 실리콘 팁 (Tap300Al, 예산 센서)를 사용하고 있습니다. 폴리머의 5×5 μm 지역은 9 측정합니다. 루트는 제곱 (RMS) 거칠기가 SPIP 배치 처리 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에 대해이 지역에서 측정됩니다 의미합니다. 각각의 이미지는 처음 거칠기 측정을하기 전에 평평하고 있습니다. 모든 이미지는 수동보기는 거칠기 측정에서 제거해야 할 수도 있습니다 이미징 유물을 확인해야합니다. 이 단계 동안 이미지는 일반적인 표면 기능 9에 따라 분류 할 수 있습니다. X-선 광전자 분광법 (XPS) microarray 슬라이드는 이중 양면 테이프를 사용하여 샘​​플 모음에 부착하고 이후 Kratos 축 울트라 XPS의 악기의 샘플 챔버에로드됩니다. 샘플 챔버로 입력하고 10 -8 토르 아래의 압력에 도달 할 때까지 기다리십시오. 적절한 작업이러한 monochromated x-선 소스 (알, 1486.​​6 EV)와 같은 매개 변수, 양극 (10kV 및 15mA) 잠재력과 현재, 조리개 크기 (110μm), 패스 에너지 (고해상도 스캔에 대한 다양한 스캔 20 EV 80 EV)는 아르 선택. X-선 소스는 microarray의 두 반대 모서리를 사용하고 샘플에서 산소 신호를 최적화 초점을 맞추고 있습니다. 개별적의 x와 y 위치는 다음 결정과 위치 목록으로 기록됩니다. 프로그램 차트는 다양한 스캔 및 특정 요소에 대한 고해상도 스캔 등의 데이터의 취득을 위해 작성하고 실행됩니다. 라만 분광법 라만 스펙트럼은 라만 현미경 LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon)를 사용하여 각 폴리머 곳으로 이동됩니다. 처음에는 라만 신호는 실리콘 웨이퍼와 520.7 cm -1에서시의 라만 변화를 사용하여 보정합니다. 예제는 다음 단계에 위치하며 레이저 (파장 = 523 nm 정도)의 초점은 CH 라만 변화를 최대화하도록 조정됩니다2천9백50센티미터 -1에서. microarray의 왼쪽 상단 지점의 중심의 위치는 다음 microarray의 기원과지도로 설정하는 것은 labRAM HR 소프트웨어에 배열 기능을 사용하여 설정합니다. 10 스펙트럼은 0.5 s의 조사 시간을 각각의 샘플에 대한 누적 찾았습니다. 5. 세균 분석 배열은 줄기 세포, 다른 세포 유형과 박테리아 3,10,4의 첨부 파일 및 확산 등을 포함하여 다양한 생물 assays에 노출 될 수 있습니다. 여기 그림 4에 개략적으로 표시됩니다 세균 첨부 파일 분석을 설명합니다. GFP를 변형 박테리아 변종이 플라스미드는 37 박 배양되어 표현 ° 200 rpm으로 흔들어있는 50 ML 팔콘 튜브에 LB 미디어의 10 ML에 C. 박테리아 문화의 OD 600이 측정되고 충분한 야간 문화를 결과로 15 ML RPMI-1640 정의 미디어에 주사된다0.01의 최종 OD 600인치 배열은 배열 (unpolymerised 단량체, oligomers 및 용매)에서 어떤 해소 할 수있는 구성 요소를 제거하려면 10 분에 살균 증류수에 prewashed 아르 세탁 배열 슬라이드를 10 분 동안 살균 깨끗한 페트리 접시와 UV에 배치됩니다. 배열과 슬라이드 페트리 접시와 주사 RMPI-1640 미디어 15 ML에 위치가 추가됩니다. 동시에 다른 슬라이드는 페트리 접시에 배치하고 제어 같은 비 innoculatd RPMI-1640와 incubated 수 있습니다. 슬라이드 60 rpm으로 흔들어와 함께 72 시간 동안 37 ° C에서 incubated 수 있습니다. 슬라이드는 멸균 PBS의 15 ML로 두 번 세척하고 있습니다. 슬라이드는 멸균 증류수 15 ML로 두 번 세척하고 있습니다. 슬라이드에는 에어컨이 건조 있습니다. 슬라이드는 488 나노 미터 여기 레이저 및 표준 청색 발광 필터 (510-560nm)로 GenePix 자동 로더 4200AL 스캐너 (분자 장치, 미국)를 사용하여 이미지로되어 있습니다. 대표 폴리머 autofluorescence 이미지입니다그림 2에 표시된. 이것은 GFP의 붕괴를 피하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 이렇게 할 수없는 경우 셀 고정을 받아야한다. 또한, 알려진 세균 응답 적절한 긍정적 인 컨트롤의 포함은 결과를 정상화하고 양적 비교 할 다른 일에 실시 실험을 허용 할 수에 필수적입니다. 폴리머 장소에서 총 형광 강도는 GenePix Pro 6는 소프트웨어 (분자 장치, 미국)를 사용하여 획득합니다. 이것은 박테리아와 바로 미디어와 incubated 모두 슬라이드에 완료됩니다. 박테리아의 성장으로 인해 형광을 찾으려면 미디어 컨트롤에 형광 박테리아가 incubated 슬라이드에 측정 한 형광에서 공제됩니다. 슬라이드는 30 분 실내 온도 20 μM SYTO17 핵산 염료 (Invitrogen, 영국)에 의해 물들과 젠 2,009 이미징 소프트웨어 (칼 Zeiss, 독일)와 칼 Zeiss LSM 700 레이저 스캔 현미경을 사용하여 이미징 할 수 있습니다. 박테리아의 범위표면에 오픈 소스 이미지 J 1.44 소프트웨어 (보건 국립 연구소, 미국)를 사용하여 결정됩니다. 6. 대표 결과 인쇄 조건은 최고 품질의 폴리머 microarrays를 인쇄하도록 최적화되었습니다. 습도는 30~40% 사이에서 보관해야합니다. 이 습도가 pHEMA 레이어를 팽창 및 기판에 고분자의 물리적 함정 수사를 허용하기에 충분하다고 제안, 수성 환경에서의 폴리머 명소 30% 아래의 습도에 인쇄 된 배열에 자주 관찰되었다 박리. 습도는 폴리머 장소의 직경을 변경하기 위해 추가로 증가하지만,이 단량체 화학에 의존 할 수 있습니다. 예를 들어, 어디 중합 솔루션의 동일한 볼륨은 MO의 친수성 ​​에틸렌 글리콜 잔기 동일한 볼륨하면서이 포함 된 단량체에 대한 인쇄와 습도가 증가 된 것처럼 40~80%에서 현장 직경 430 μm에서 370 μm로 감소되었다소수성 지방족 탄소 고리 구조를 포함하는 nomer 그 자리 직경 290 μm에서 350 μm (그림 5)로 증가했다. 중합의 정도는 1천7백20센티미터 -1에서 C = O 라만 근무를 표준화해야 1천6백40cm -1에서 감지 C = C 라만 변화를 측정하기 위해 라만 분광법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 라만 스펙트럼이 다양한 UV 노출 (그림 6)에 대한 polymerized 폴리머 명소에 대한 측정되었다. C = C : C = UV 노출은 0에서 50 s로 증가로 O 비율에서 추가 감소없이 뭘로 감소 C = C : C = O의 비율이 더 UV의 조사 (그림 6)과 관찰되었다. 라만 스펙트럼은 다양한 O 2 수준과 C = O 2 수준은 2000 PPM로 감소 된로 C 라만 변화는 그러나 더 이상 감소가 (이 아래 O 2 수준에 대한 관찰되지 않았습니다, 관찰 된 그림 7A에서 polymerized 폴리머 장소에 대해 측정 하였다 ). 라만 분광법은 또한 진공 추출 s의 능력을 증명unpolymerized의 단량체을 제거 할 tep. 이전 진공 추출에 C = C 라만 변화는 2000 PPM (그림 7A)에 비해 3,300 ppm으로의 polymerized 폴리머에 대한 더했습니다하지만, 진공 추출 후 라만 변화의 높이 모든 unpolymerized의 모노머을 제안, (그림 7B) 구분할 수 있습니다 진공 추출 단계에서 제거되었습니다. 요약하자면, 중합 조건 30~40%의 습도, 7 일 동안 인쇄 후 진공 추출 단계 2000 ppm으로 아래의 O 2 수준 50 초보다 더 큰 UV 노출이 포함되어 있습니다. 인쇄 및 진공 추출 후 고분자 명소 중합의 성공은 식별 할 수있는 간단한 가벼운 현미경과 변칙 현장 morphologies에 의해 평가 될 수있다. 일반적으로, 장소는 왼쪽에있는 그림 8에 도시 된 바와 같이, 원형 및 균일 나타납니다. 기하학의 변화에​​ 대한 원인은 손상된 또는 부정 핀입니다. 단량체 조합의 작은 수에 우리는 전자를 들어, 결함 부분을 관찰 한대형 상단에있는 중앙 지점이있는 곳 오른쪽에 그림 8에 표시된 작은 장소, 또는 튀김 달걀 모양의 위성을 가진 중앙 자리를 xample, 장소에 기뻐하고 있지. 이것은 전에 단량체의 점도, 친수성, 휘발성 또는 표면 장력의 차이와 단량체 조합이이 형식과 호환되지 않습니다 것을 제안과 관련된 인쇄에 대한 위상 분리로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 ToF – 심스와 같은 기술에 의한 고분자 명소의 추가 화학 매핑도 명소 배열에서 자료를 '화학의 분포를 결정하는 중요하고 때로는 필요한 품질 관리 단계입니다. 이 기술은 과도한 빛 현미경으로 볼 수없는 몇 가지 재료의 확산을 파악하고 각각의 폴리머 장소에서 위상 분리를 식별 할 수 있습니다. 그림 1. 도식은 PO의 형성에 관련된 다양한 단계를 묘사lymer 명소. 그림 2. 처음에 소스 판의 모노머로 핀을로드 한 후 접촉하여 기판에 단량체를 증착과 관련된 핀 인쇄 방법의 도식. 핀 XYZ 로봇 팔에 의해 제어됩니다. 삽입은 생산 후 배열에서 autofluorescence의 전형적인 이미지를 보여줍니다. 그림 3. HTSC 있으며, 폴리머 microarrays의 연구에 적용 bioassays과 관련된 기술을 강조 도식. 그림 4. 세균 첨부 파일 분석의 도식. 그림 5. P4 – 터 셔리 – butylcyclohexyl 아크릴 레이트 및 디 (에틸렌 글리콜) 에틸 에테르 메타 크릴 레이트 : olymer 스폿 직경 두 개의 다른 단량체에 대한 다양한 습도에 출력한다. 그림 6.에 대한 라만 강도의 비율 C = 1천6백40센티미터 -1하고 다양한 UV 노출 4 – 터 셔리 – butylcyclohexyl 아크릴 레이트의 폴리머 장소에서 -1 1천7백20cm의 C = O 라만의 변화에서 C 라만 변화. 오류 바 같은 하나의 표준 편차 (N = 3). 그림 7. 다양한 O 2 층에서 인쇄 4 – 터 셔리 – butylcyclohexyl 아크릴 레이트의 폴리머 명소에 대한 측정 라만 스펙트럼, 각 스펙트럼의 왼쪽에 표시 (A) 전에 (B) 진공 추출 후. C = 1천7백20cm에서 1,640센티미터 -1과 C = O 라만의 변화에서 C 라만 변화 -1에 대한 라만 강도의 비율 </suP> 각 스펙트럼의 오른쪽에 표시됩니다. 그림 8. 2 폴리머 명소 가벼운 현미경 이미지입니다. 왼쪽에있는 점은 잘 형성 장소를 보여주고, 오른쪽에 자리를하면서는 단량체 매우 unevenly 배포를 포함하는 곳의 예입니다. 규모 바는 500 μm이다.