Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen
概要
Wir beschreiben, wie retroviralen oder lentiviralen Infektionen der Überexpression oder shRNA-Konstrukte, die in das menschliche Ramos B-Zell-Linie und wie somatische Hypermutation in diesen Zellen zu messen. Durchführen
Abstract
B-Zellen beginnen ihr Leben mit niedriger Affinität Antikörper durch V (D) J-Rekombination erzeugt. Doch beim Erkennen eines Krankheitserregers, wird die Variable (V) Region eines Immunglobulins (Ig)-Gen etwa 100.000-fach stärker als der Rest des Genoms durch somatische Hypermutation (SHM), mutiert wodurch Antikörper mit hoher Affinität 1,2. Darüber hinaus produziert der Klasse Switch-Rekombination (CSR)-Antikörper mit verschiedenen Effektor-Funktionen, je nach Art der Immunantwort, die für einen bestimmten Erreger benötigt wird. Beide CSR und SHM durch activation-induced Cytidindeaminase (AID), die Cytosin-Reste in DNA um Uracile produzieren desaminiert eingeleitet. Diese Uracile sind fehleranfällig Formen der Reparaturwege verarbeitet, was schließlich zu Mutationen und Rekombination 1-3.
Unser gegenwärtiges Verständnis der molekularen Details der SHM und CSR komme aus einer Kombination von Studien an Mäusen, primäre Zellen, Zelllinien und Zell-free Experimente. Mausmodelle bleiben den Goldstandard mit genetischen Knockouts zeigt eine entscheidende Rolle für viele Reparatur-Faktoren (zB Ung, MSH2, MSH6 Exo1 und Polymerase η) 4-10. Allerdings sind nicht alle Gene zugänglich für Knockout-Studien. Zum Beispiel sind Knockouts von mehreren Doppelstrangbruch Reparatur-Proteine embryonal letalen oder beeinträchtigen B-Zell-Entwicklung 11-14. Darüber hinaus manchmal die spezifische Funktion eines Proteins in SHM-oder CSR kann durch weitere globale Defekte, die durch die Ko verursacht maskiert werden. Darüber hinaus können seit Experimente in Mäusen als langwierig, zu verändern Expression einzelner Gene in Zelllinien ist ein zunehmend beliebtes erste Schritt zur Identifizierung und Charakterisierung Kandidatengene 15-18.
Ramos – ein Burkitt-Lymphom-Zelllinie, die konstitutiv erfährt SHM – ein beliebtes Zell-Linie Modell SHM 18-24 Studie. Ein Vorteil der Ramos-Zellen ist, dass sie einen eingebauten günstigen, halb haben-Quantitatives Maß für SHM. Wildtyp-Zellen exprimieren IgM und, wie sie abholen Mutationen, einige der Mutationen knock out IgM Ausdruck. Deshalb Testen IgM Verlust durch Fluoreszenz-activated cell Scanning (FACS) bietet einen schnellen Auslesen für die Höhe der SHM. Eine quantitative Messung der SHM kann durch direkte Sequenzierung der Antikörper-Gene erreicht werden.
Seit Ramos-Zellen schwer zu transfizieren sind, produzieren wir stabile Derivate, die erhöht oder gesenkt haben Ausdruck eines einzelnen Gens durch Infektion der Zellen mit retroviralen oder lentiviralen Konstrukte, die entweder eine Überexpression Kassette oder eine kurze Haarnadel-RNA (shRNA), jeweils enthalten. Hier beschreiben wir, wie wir Ramos Zellen zu infizieren und dann diese Zellen die Rolle bestimmter Gene auf SHM (Abbildung 1) zu untersuchen.
Protocol
Discussion
Wie bereits erläutert, haben Zelllinie Modelle für die Antikörper-Diversifizierung zu einem beliebten Ausgangspunkt, um neuartige Proteine, die verschiedene Schritte Einfluss während Antikörper Diversifizierung zu identifizieren. Wir stellen hier ein Verfahren zur Verwendung Virusinfektion entweder knock-down oder überexprimieren Proteine in der Ramos B-Zell-Linie und dann die Auswirkungen auf SHM.
Für diese Studien nutzen wir sowohl WT Ramos und AID hallo Ramos-Zelle…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die pMSCV-AID-I-Thy1.1 und pKat2 Vektoren wurden freundlicherweise von DG Schatz und die pVSV-G, pRSV-Rev und pMDLg / pRRE Vektoren wurden freundlicherweise von BR Cullen.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
参考文献
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
