Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

1. Isolement enzymatique de la tomate cuticules 5 Placez plusieurs tomates commerciales ou cultivées dans un bol. Retirer la peau des fruits en grandes sections; jeter le péricarpe interne. Laver les peaux de tomates avec de l'eau déminéralisée et de les conserver sous l'eau dans un bécher. Préparer un pH 4,0 à 50 mM de tampon acétate de sodium (à 31 ° C) en mettant 1,22 g de trihydrate d'acétate de sodium (M r. 136,08 g / mole) et 2,34 ml d'acide acétique glacial (17,485 M) dans un bécher, ajoutant 200 ml d' de l'eau désionisée, puis ajustement du pH à 4,0 à 31 ° C. Préparer un mélange contenant 4 ml de pectinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g de cellulase (CE 232.734.4; 1,3 unités / mg de solide, Sigma-Aldrich), et 13 mg NaN 3, puis ajouter 196 ml de tampon acétate de sodium du mélange d'enzymes pour obtenir 200 ml de cocktail enzymatique finale. 5 immerger complètement la peau des tomates pelées dans le cocktail enzymatique et incuberà 31 ° C pendant 24 heures avec une agitation constante (G24 environnement Incubateur agité; New Brunswick Scientific Co.). Recueillir les peaux de tomates à l'aide d'une passoire de cuisine ou entonnoir Büchner et les laver avec de l'eau déminéralisée. Par la suite, placez-les dans un four sous vide à température ambiante pendant une heure. Préserver les peaux de tomates séchées dans une bouteille étiquetée et plafonné pour les procédures ultérieures de déparaffinage. 2. Déparaffinage exhaustive par extraction Soxhlet 6 L'équipement utilisé pour le déparaffinage exhaustive se compose d'une source de chaleur (chauffage manteau et Variac contrôleur), ballon à fond rond pour un réservoir de solvant, extraction Soxhlet, en verre fritté dé à coudre ou cartouche d'extraction jetables, anti-puces de supplantation et un condenseur (voir Fig. 1). Notez que le bras de siphon étroit (parties 6 et 7 dans la Fig. 1) est très délicate et sujette à la rupture, nécessitant une manipulation minutieuse. Mettez 0,5-1 g de peau de la tomate (obtenue enl'étape 1.) dans un mortier, et broyer l'échantillon pour obtenir une poudre grossière avec un pilon à moins que les échantillons doivent être utilisés pour les mesures AFM (section 5). Remplir une cartouche en verre fritté ou en papier à mi-chemin avec l'échantillon et à utiliser des pinces pour le placer soigneusement à la base de la colonne d'extraction. Fixer le condenseur et l'envelopper de papier d'aluminium. Chauffer le méthanol (qualité ACS) solvant, en présence de quelques anti-puces de supplantation jusqu'à ébullition doucement et reflux sur les parois du ballon. Couvrir le réservoir de solvant avec de la laine de verre à la fois et une feuille d'aluminium. Vérifier le processus pendant une heure, réglage de la tension Variac sorte que le réservoir accumule environ une goutte par seconde et le siphonnage se produit au sein de l'appareil de Soxhlet lorsque la cartouche est pleine. Continuer le processus d'extraction pendant 12 h, puis baisser le manteau de chauffage et de permettre à l'appareil de se refroidir. Retirez l'extracteur et le réservoir comme une seule unité à disposer du solvant. Utilisez tweezers pour élever la cartouche à juste en dessous du col de la colonne d'extraction, le solvant en excès s'écouler de lui, et placer la cartouche sur une surface propre. Inclinez la colonne d'extraction afin de permettre la solution dans le flacon ci-dessous. Débranchez le flacon et verser les déchets dans un récipient à déchets dûment étiqueté solvant. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour les solvants successifs de polarité diminuant progressivement, par exemple, le chloroforme et l'hexane pendant 12 h dans chaque cas. Laisser l'échantillon cutine tomates pour sécher l'intérieur de la cosse, soit par soufflage d'un courant d'azote gazeux au-dessus ou en le plaçant dans un four sous vide à température ambiante. Enfin, mesurer la masse de l'échantillon sec et de le stocker à température ambiante dans un bocal vis-dessus scellée avec du parafilm. 3. Isolement sélectif des cires épicuticulaires et Intracuticular 3,4 D'abord, lavez les tomates entières (un lot distinct de tomates de celles décrites en 1.) Avec de l'eau distillée. Séchez-les avec papserviettes er et Kimwipes et placez-les souches à la baisse sur un morceau de papier d'aluminium. Peignez les tomates entières avec 120% (ratio de la masse w / w,) la gomme arabique solution aqueuse dans un top-down de mode et de permettre à environ une heure pour la gomme arabique à sécher sur la peau du fruit, laissant une fine pellicule. Retirez ce film en utilisant des pinces, en prenant soin de ne pas percer la peau de la tomate. Répétez la procédure une fois de plus. Ajouter des films dans des flacons contenant 1:1 (v / v) de chloroforme-eau et mélanger pendant trois minutes. Après une agitation vigoureuse et une séparation de phase, pipeter les fractions de chloroforme et les flacons séparés s'évaporer dans découverts, laissant la cire épicuticulaire. Les tomates restera physiquement intact. Trempez-les dans du chloroforme pour les deux minutes à température ambiante et de recueillir la cire intracuticular après évaporation du solvant. Maintenant, peler les tomates et les traiter par voie enzymatique (avec de la cellulase et la pectinase dans du tampon acétate de sodium) pour enlever la cellulose et pectine, respectivement (comme décrit dans <strong> 1). Si vous le souhaitez, effectuer un déparaffinage exhaustive sur ces cuticules isolées enzymatiquement par extraction Soxhlet (voir étape 2), en utilisant trois solvants de polarité variable (méthanol, le chloroforme et l'hexane, respectivement). 4. Caractérisation moléculaire de cutine fruit de la tomate par la Croix-polarisation Magic-angle spinning à l'état solide résonance magnétique nucléaire (CPMAS ssNMR) 6 Lieu 4-6 mg de cuticules de tomate pleinement déparaffinées (enclenchements) dans un rotor de 1,6 mm fastMAS zircone en utilisant le fournisseur fourni outil d'emballage. (Soit les cuticules au sol de tomate déparaffinées ou très petits morceaux de cuticules partiellement déparaffinées sont adaptés.) Veiller à ce que l'échantillon est emballé de manière uniforme, mais pas trop serré, dans le rotor. Après avoir mis sur le capuchon supérieur, peindre la moitié du capital avec un marqueur à encre noire pour faciliter les mesures de la vitesse de rotation. Régler le calage du spectromètre RMN pour la largeur de ligne minimale spectrale à mi-hauteur d'une calibrer le proton (H 1) et de carbone (13 C) 90 ° largeurs d'impulsion en utilisant un composé standard tel que l'adamantane. Utilisation de la glycine ou la glutamine comme composés modèles, d'obtenir l'intensité maximale du signal en optimisant tous les paramètres (Hartmann-Hahn niveaux de puissance correspondant, 1 h – 13 temps de contact C, hétéronucléaire 1 H découplage de résistance) de la polarisation croisée à l'angle magique de filature (CPMAS) expérience. Pour spectres obtenus à une fréquence 1 H à 600 MHz, les conditions recommandées comprennent de 10 kHz ou 15 kHz filature, un délai de 3-sec entre les acquisitions, et RACHIDIENNE protons hétéronucléaire découplage 7 à une intensité de champ magnétique correspond à une fréquence de 185 kHz. Insérez le rotor cutine-emballé dans la sonde. Ensuite, placer la sonde dans l'aimant. Augmenter la vitesse de filage jusqu'à 10 kHz progressivement pour vérifier emballage bon échantillon et la stabilité du rotor. Vérifier la stabilité de filage finale du rotor à l'intérieur± 20 Hz. Ajustez la mise au point et l'appariement des condensateurs de la sonde de manière itérative pour obtenir une réflexion minimum de puissance à la fois 1 H et 13 C RMN fréquences. Réglez la température expérimentale à 25 ° C (ou température ambiante). Commencer l'expérience pré-optimisée CPMAS correspondant à la condition de Hartmann-Hahn correspondant à la fréquence déterminée de 10 kHz filature. Acquérir 4096 transitoires, l'état du spectre avec exponentielle (lorentzienne) l'élargissement des raies de 50-100 Hz, et de faire une transformée de Fourier pour générer un spectre RMN de l'intensité du signal par rapport à blindage chimique (ppm). Référence du produit chimique C 13 quarts de travail à l'extérieur en utilisant ensemble l'adamantane à 38,4 ppm (-CH 2 – groupe) 8 en tant que norme. Augmenter la fréquence du rotor de filature à 15 kHz et répéter la mesure CPMAS (étapes 4.6-4.8) correspondant à la condition de Hartmann-Hahn correspondant à cette fréquence déterminée ci de tourner. Repeles expériences CPMAS (étapes 4.1-4.9) avec naturelles (cire) et partiellement déparaffiné échantillons de fruits cuticules. 5. Sondage de la surface de la cuticule de tomates avec la microscopie à force atomique (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procédures varient légèrement entre les microscopes) 6 Allumez le microscope à sonde locale (SPM) (Fig. 2) et assurez-vous que le commutateur de mode microscope toggle est définie sur la microscopie à force de contact atomique (AFM) mode. Manuellement relever la tête en tournant ses SPM deux boutons avant réglables par l'utilisateur. Détachez le tipholder AFM de la tête SPM en tournant la vis de serrage à l'arrière de la tête. Utilisez des pinces pour enlever le cantilever AFM existant de la tipholder, puis soigneusement prendre un nouveau levier silicium nitrure (AFM sonde) de son emballage et installez-le à la place de l'ancienne porte à faux. Utilisation d'un microscope optique pour vérifier que le cantilever nouvellement installé AFM ne se décompose pas. Fixez el'échantillon e cuticule de la tomate (une section de la cuticule de tomate partiellement déparaffinée ~ 10 mm x 10 mm) à un disque en acier inoxydable (échantillon rondelle) avec un adhésif double face. Utiliser un microscope optique pour vérifier que le surface de la cuticule reste plane et lisse après le placement de l'échantillon sur la rondelle. Placer la rondelle avec l'échantillon cuticule de tomate sur la région magnétique au sommet du scanner SPM. Définissez les deux vis de réglage manuel avant de le scanner haute en tournant les boutons; régler la vis de réglage arrière motorisé à environ le même niveau que les deux autres vis à l'avant. Assurez-vous que tous les trois vis sont suffisamment élevés pour éviter de casser la pointe de l'AFM lors de la passation de la tipholder dans la tête de SPM. Réinsérez le tipholder dans la tête de SPM et le fixer en serrant la vis de serrage à l'arrière de la tête. Après avoir allumé le laser, aligner le spot laser sur le cantilever AFM en utilisant la centrale (y) et de droite (x) boutons de réglage laser sur le dessus de la tête.Surveiller le faisceau laser réfléchi sur un morceau de papier pour positionner le spot laser exactement à la fin du cantilever AFM. Ajuster la position du miroir mobile itérative en utilisant les boutons de réglage de photodétecteur pour obtenir un signal maximal (signal SUM), assurant ainsi que le faisceau laser réfléchi est reçu par uniformément les quatre quadrants de la photodétecteur. Abaissez la pointe de l'AFM en rétractant les vis manuelles avant d'ajustement et de la vis de réglage arrière motorisé du scanner SPM, contrôler visuellement l'approche de la pointe de l'AFM vers la surface de l'échantillon avec un microscope inversé. Assurez-vous que tous les trois vis sont au même niveau pour éviter les artefacts de l'imagerie d'un échantillon incliné. Apportez la pointe vers l'échantillon, mais pas si proche que les touches de pointe ou des ruptures à travers la surface de l'échantillon. À ce stade, la lumière laser réfléchie par le cantilever AFM rebondir sur le miroir mobile vers le photodétecteur. Pour le mode de contact AFM avec un siliconecon nitrure AFM pointe, régler le signal de sortie (Déviation verticale) de tension à -2 V pour une valeur de consigne 0 V et le signal DIFF (vertical / horizontal de différence) à 0 V en ajustant la position du miroir. Utilisation du logiciel Nanoscope, cliquez sur l'icône loupe et sélectionnez le profil approprié (Contact Mode AFM). Utilisation de la "commandes de numérisation Paramètres" du panneau, réglez la vitesse de balayage et par exemple la taille de numérisation, de 10 microns format de numérisation et 2 vitesse de balayage Hz. Laisser la pointe d'AFM pour engager la surface de l'échantillon en cliquant sur l'icône engager pointe. En contrôlant la vis arrière motorisé de la base de SPM, le programme va maintenant diminuer la pointe jusqu'à ce qu'elle s'engage dans la surface de l'échantillon. Le processus de numérisation démarre automatiquement une fois la pointe a engagé avec succès. Surveiller le processus de numérisation à l'aide des deux modes d'image et de la portée du logiciel, le réglage des paramètres tels que la consigne, gain intégral, gain proportionnel, la taille de numérisation, vitesse de balayage, des lignes et des échantillons / ligne de manière itérative pour réaliser la plus forteimages à haute résolution. Démarrer le balayage avec une grande plage de l'axe z (échelle de données); ensuite soigneusement réduire la valeur de l'échelle des données d'observer le meilleur contraste de caractéristiques de surface sur l'image. Minimiser l'apparition de zones blanches de l'image numérisée, qui indiquent que la hauteur des éléments de surface est supérieure à la disposition de l'axe z plage. Capturer l'image pour enregistrer le fichier de données, puis traiter les données en utilisant des fonctions d'aplatissement pour supprimer les artefacts d'image dus à la dérive de balayage vertical (Z), des arcs d'image, et décalage vertical entre les lignes de balayage, 9 enfin calculer la rugosité moyenne. Après avoir enregistré les données, rétracter la pointe de l'AFM en inversant l'action du moteur vis commandé par ordinateur qui a été utilisé pour l'engager. Traitement de l'image peut être effectuée en mode déconnecté d'analyse d'images et / ou en utilisant un autre ordinateur. Utilisez les boutons avant de fond en métal gris de la porte-embout à changer les positions x et y de la zone de numérisation, puis répéter la mesure à cinq loca échantillontions pour vérifier la reproductibilité, le remplacement de la console AFM si la qualité d'image se détériore. 6. Les résultats représentatifs Analyse du déplacement chimique de la CPMAS 13 spectres RMN C (Fig. 3) a identifié les principaux groupes fonctionnels présents dans la cuticule de tomate exhaustive déparaffinées (cutine). Les fragments de carbone clés dans le biopolyester cutine ont été jugés à longue chaîne aliphatiques (0-45 ppm), aliphatiques oxygénés (45-110 ppm), se multiplient-collés et aromates (110-160 ppm), et carbonyles (160-220 ppm). Les groupements oxygénés alkyle (CHO + CH 2 O) jouent un rôle crucial dans l'établissement de connexions covalentes entre les unités monomères de cutine le biopolymère, formant ainsi l'architecture moléculaire de la matrice cutine. Les différences dans les surfaces relatives des pics observés dans la région spectrale entre 45 et 100 ppm suggèrent que la cutine mutant a une proportion relativement importante de cross-link structura formation CHO fractions l par rapport à la de type sauvage cutine; minutieuses des mesures quantitatives en utilisant la polarisation directe (DPMAS) RMN 5 méthodes appuyer cette conclusion (données non présentées). CPMAS 13 C RMN également de la cire présente un pic progressivement dégressif à 31 ppm (fig. 4), indiquant l'élimination séquentielle d'épi-et cires intracuticular à partir du composite cutine-cire, tout en conservant l'architecture chimique principal du biopolymère cutine. Parallèlement l'analyse d'image AFM (Fig. 5) a révélé des irrégularités de surface dues à l'extraction progressive des épi-et cires intracuticular de la cuticule des fruits, ce qui signifie des modifications dans l'organisation de l'assemblée cuticulaire. . Figure 1 extracteur Soxhlet (source image: Wikipedia). "/> Figure 2. Un microscope) sonde à balayage. B) la tête SPM (adapté du manuel de formation fournis par l'AFM Digital Instruments). Figure 3. 150 MHz CPMAS 13 C RMN de manière exhaustive déparaffinées rouges mûrs cuticules fruits de tomate (enclenchements) de type sauvage (M82) et mutant (CM15) montrent des résonances avec les déplacements chimiques correspondant à des groupes fonctionnels d'un acide gras hydroxy réticulé à base de polyester et aussi quelques fragments se multiplient en servitude. Tous les spectres ont été acquis avec une fréquence de 10 kHz de filage. Figure 4. 150 MHz 13 CCPMAS spectres RMN commerciaux rouges mûrs cuticules fruits de tomate présentent des changements de composition lors de l'enlèvement séquentiel des cires épicuticulaires et intracuticular par la gomme extraction mécanique arabe et un two minutes dip chloroforme, respectivement. Tous les spectres ont été acquis avec une fréquence de 15 kHz de filage. Figure 5. Images AFM et les estimations de rugosité pour la tomate partiellement déparaffinée commerciale cuticules décrit dans la figure 4, après le retrait par étapes des épicuticulaires (à gauche) et intracuticular (à droite) les cires.