Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.
Manikür, karasal bitkilerin üstü kısımları bir hidrofobik koruyucu tabaka, çeşitli biyotik ve abiyotik streslere karşı çok yönlü bir savunma bariyeri gibi fonksiyonlar ve ayrıca dış ortamdan su akışını düzenler. 1 A biopolyester (kütin) ve uzun zincirli yağ asitleri ( mumlar) kütikül başlıca yapısal çerçeve oluştururlar;. cuticular tabakasının işlevsel bütünlüğü kütin biyopolimer ve 'intracuticular' mumlar 2 Burada oluşan karışımı, biz kapsamlı bir protokol tarif dış 'epikütikülar' katmanın yanı sıra bağlıdır ticari domates (Solanum lycopersicum) meyve tırnak etlerini etraflıca mumları çıkarmak için ya da kütikül kompozit arasında kademeli ve seçici epikütikülar ve intracuticular mumları çıkarmak için. Ve uygun su jetleri Schäffer (2001) yönteminin meyve kütikulasının gelen epikütikülar ve intracuticular mumların aşamalı çıkarılması için adapte edilmiştir. 3,4 izlemek içinsıralı balmumu çıkarılması, solid-state çapraz polarizasyon sihirli açı-eğirme süreci (CPMAS) 13 C NMR hakkında bilgi tamamlanmaktadır dökme malzemelerin moleküler düzeyde yapısal profiller sağlayan, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile paralel olarak kullanılmıştır mikro topografya ve cuticular yüzeylerin pürüzlülüğü. Ekilmiş vahşi tip ve tek-geni mutant domates meyveler mumu alınmış cuticles bir çapraz bağlama yeteneği değerlendirmek için, MAS 13C NMR oksijenli alifatik (CHO ve CH2 O) kimyasal yarımların nispi oranları karşılaştırmak için kullanıldı.
Kütin biopolyester kimyasal yapısı korurken polariteyi değişen çözücü, bir panel ile aşamalı Soxhlet ekstraksiyon ayrıntılı Mum eritme, bunların alifatik ve aromatik bileşenlerin hidrofobik özelliklerine göre balmumu yarımlar izole etmek için etkili bir yol sağlar. Epikütikülar mumlar ve sele mekanik ekstraksiyontamamlayıcı fiziksel yöntemler ile takip intracuticular mumların ctive kaldırılması, manikür montaj araştırmak için eşi benzeri görülmemiş bir araç sağlar: Bu yaklaşım supramoleküler organizasyon ve mumlar çeşitli yapısal entegrasyon, kütin-balmumu matris mimarisi ve kimyasal açığa her bir bileşenin bileşimi. Buna ek olarak, katı halde 13C NMR vahşi tip ve kırmızı olgun mutant domates meyve ve CHO CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları farklılıklar gösterir. NMR teknikleri parmak izi, çözünmeyen amorf ve kimyasal heterojen cuticular malzemelerin moleküler yapısı için olağanüstü araçlar sunuyoruz. Noninvaziv bir yüzey seçkin bir görüntüleme tekniği olarak, AFM nm-mikron uzunluğunda ölçekte cuticular montaj yapısal organizasyonu araştırmak için etkin ve doğrudan vasıta vermektedir.
Protokoller Burada yıkıcı kimyasal dökümü için gerek kalmadan karmaşık dirençli bitki materyali ayrıntılı moleküler ve mikro karakterizasyonu için izin nitelendirdi. Biz heterojen cuticular karışımından epikütikülar ve intracuticular mumların seçici çıkarılması için prosedürler yürütülen ve izlenen cuticular montaj yapısal organizasyon, 10 kontrol, çeşitli lipidler (balmumu) ile kütin biopolyester harmanlama araştırmak. Solid-state 13 C NMR ekili wild-tip ve tek-gen cutins arasında çapraz bağlantı yeteneklerini karşılaştırmak için balmumu moleküler bileşenleri çıkarıldığı ölçmek için kullanılan, ve atomik kuvvet mikroskobu yüzey pürüzlülüğü eş zamanlı değişiklikleri incelemek için görev yaptı. 6,11 oldu mutant domates meyveleri, katı hal 13C NMR da CHO ve CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları tahmin etmek için kullanıldı.
Tasarım özelliği bir diziBu protokol s dikkat çekicidir. Balmumu malzemeleri farklı kutuplar sahip solventler bir dizi meyve kütikül tedavisinde, lipidler geniş bir kapsayacak şekilde ayrıntılı Mum eritme elde etmek esastır. Buna ek olarak, Mum eritme süresi 8 saat arasında kütikula örnekleri doğasına bağlı olarak, 24 saate kadar değişmektedir. Sağlam meyve kütikül gelen sürekli epikütikülar mumlar ayıklamak için, yüzeye eşit yapışkan kaplama uygulamak şarttır.
Solid-state CPMAS 13 C NMR 12 kendi doğal fiziksel özelliklerini koruyarak oldukça heterojen ve çözünmez bitki biyopolimerlerin çeşitli yapısal bileşenlerinin belirlenmesi için hızlı bir kalitatif yöntemdir; 13 geleneksel çözüm-devlet NMR da ayıklanan balmumu karışımları karakterize etmek için kullanılabilir. Fonksiyonel grupların nicel tahmin bozulmamış bitki polimerler, 5 yüksek kaliteli doğrudan polarizasyon sihirli açı iplik (D isteniyorsaPMAS) 13C NMR 5,14 tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılabilir. Fonksiyonel grupların doğru kantitatif geri dönüşüm süreleri, uyarma darbe uzunlukları ve heteronükleer çözülmenin gücü dikkatli optimizasyonu gerektirir. 15 heteronükleer dekuplaj TPPM 16 veya 50 kHz ile 185 kHz arasında değişen 1 H alan şiddeti için ayarlanabilir SPİNAL 7 metodolojileri. Bu parametrelere ek olarak, CPMAS ölçümlerin hassasiyeti spin-kilit zaman ve Hartmann-Hahn eşleşen durumuna bağlıdır. Geleneksel CPMAS yerine 15, rampalı bir amplitüdlü CP (RAMPA-CP) tekniği çapraz üst düzeye çıkarmak için uygulanabilir spin-kilit süresi (veya tersi) sırasında sabit 13 C alan gücü genliği tutarken lineer 1 H genliği değişen (~% 20-50) veya teğet by-polarizasyon verimliliği. az CPMAS ölçümleri yapılması 17,18 İki farklı ro minimumtor-iplik frekansları ana spektral tepelerinden iplik sidebands ayırt etmek şarttır.
Temas şeklinde yapılan eşzamanlı AFM ölçümleri mumsu bileşenlerinin sıralı çıkarılması sırasında, örneğin yüksek tarama hızı ve yüksek çözünürlüklü, 19 ile kütikül yüzey durumunun doğrudan görüntüleme sağlar. Her iki durumda da (temassız) modu yanal (kesme) kuvvetleri nedeniyle olası hasar kaçınarak ve numune yüzey kazıma, narin "yumuşak" Bitki materyallerinin yüzey karakterizasyonu için bir alternatif olarak kullanılabilir. 5,20 dokunarak yılında AFM İşletim , yüzey üzerinde aynı noktada birden fazla görüntü sıralı satın AFM ölçümlerde "prob-yüzey etkileşimleri" nedeniyle herhangi bir yüzey hasarı belirlemek için hizmet vermektedir. 6,21 iyi tekrarlanabilirlik için, yumuşak cuticular yüzeyler için uygun yay sabitleri ile AFM probları olmalıdır sıcaklık ve nem kullanılan ve süreklilik sağlanmalıdır. 6,15,20 </skadar katı hal NMR Oysa> topluluk ortalaması (dökme) domates meyvesinin tırnak etlerini özelliklerin moleküler profili sunan, atomik kuvvet görüntüleme bu zarif karmaşık makromoleküler meclislerinin yüzey topografisi izlemek için tamamlayıcı bir noninvaziv prob 22,23 sağlar. 1,2
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı hibe # MCB-0741914 ve MCB-0843627 tarafından desteklenmiştir; ek altyapı desteği 2 Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi'nden G12 RR03060-26 tarafından New York City College sağlanmıştır. Biz minnetle JKC M82 (yabani tip) ve CM15 (mutant) domates tırnak etlerini sağlamak için Cornell Üniversitesi Bitki Biyolojisi Bölümü grup Rose kabul ediyorsunuz. Biz AFM deneyler yaptığı cömert yardım için Prof Alexander Couzis arasında CCNY Kimya Mühendisliği grubundan Dr Spyros Monastiriotis teşekkür ederim. Biz grafik tasarım desteği için Bayan Lauren Gohara teşekkür ederim.
Name of the reagent | Company | Catalog no. | コメント |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
Variac Controller | |||
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
Glass wool | VWR | RK20789 | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
Tweezers | VWR | 82027-452 | |
Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
Nitrogen gas | |||
Parafilm | VWR | 52858 | |
Paper towels | VWR | 89002-984 | |
Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
Gum arabic | Sigma | G9752 | |
1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
Light microscope | Digital Instruments | ||
Magnetic puck | Digital Instruments | ||
Double sided tape | VWR | ||
Fruit Peeler | |||
Büchner funnel | VWR | 89038 |