El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

1. Aislamiento enzimática de las cutículas de tomate 5 Coloque los tomates varios comerciales o cultivadas en un recipiente. Pelar la piel de las frutas en grandes secciones; descartar el tejido del pericarpio interior. Lavar las pieles de tomate con agua desionizada y preservar ellos bajo el agua en un vaso de precipitados. Preparar un 50 mM pH 4,0 tampón acetato de sodio (a 31 ° C) poniendo 1,22 g de acetato de sodio trihidratado (M r. 136,08 g / mol) y 2,34 ml de ácido acético glacial (17.485 M) en un vaso de precipitados, añadiendo 200 ml de agua desionizada, y luego ajustando el pH a 4,0 a 31 ° C. Preparar una mezcla que contiene 4 ml de pectinasa (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI América), 0,2 g de celulasa (CE 232.734.4; 1,3 unidades / mg de sólido, Sigma Aldrich), y 13 mg de NaN 3, y luego añadir 196 ml de tampón acetato de sodio a la mezcla de enzimas para obtener 200 ml del cóctel de enzimas final. 5 Sumerja completamente la piel de tomate pelado en el cóctel de enzimas e incubara 31 ° C durante 24 horas con agitación constante (G24 Ambiental Incubadora de Shaker, New Brunswick Scientific Co.). Recoge las cáscaras de tomate con un colador de cocina, o el embudo Büchner y se lava con agua desionizada. Posteriormente, los coloca en una estufa de vacío a temperatura ambiente durante una hora. Preservar las pieles secas de tomate en una botella etiquetada y tapada para los procedimientos de desparafinado subsiguientes. 2. Desparafinado exhaustiva por extracción Soxhlet 6 El equipo utilizado para desparafinado exhaustiva consta de una fuente de calor (calefacción manto y el controlador Variac), matraz de fondo redondo de un depósito de disolvente, extractor Soxhlet, dedal de vidrio sinterizado o cartucho de extracción desechable, los chips anti-golpes y un condensador (ver fig. 1). Observe que el brazo sifón estrecho (partes 6 y 7 en la figura. 1) es muy delicado y propenso a la rotura, lo que requiere un manejo cuidadoso. Ponga 0.5-1 g de piel de tomate (obtenido en elel paso 1.) en un mortero, y moler la muestra a un polvo grueso con un mortero a menos que las muestras se van a utilizar para las mediciones de AFM (Sección 5). Llenar un dedal de vidrio sinterizado o desechables aproximadamente hasta la mitad con la muestra y utilizar pinzas para colocar cuidadosamente en la base de la columna de extracción. Poner el condensador y se envuelve con papel de aluminio. Calentar el disolvente de metanol (grado ACS) en presencia de unos pocos anti-bumping virutas hasta que hierva suavemente y reflujos en las paredes del matraz. Cubrir el depósito de disolvente con lana de vidrio tanto y papel de aluminio. Ver el proceso para una hora, ajustar el voltaje Variac manera que el depósito se acumula sobre una gota por segundo y sifón se produce dentro del aparato Soxhlet cuando el dedal está lleno. Continuar el proceso de extracción durante 12 h, luego baje la manta calefactora y permitir que el aparato se enfríe. Quitar el extractor y el depósito como una sola unidad para disponer del disolvente. Utilice pinzasrs para elevar el dedal a justo por debajo del cuello de la columna de extracción, drenar el exceso de disolvente a partir de ella, y colocar el cartucho en una superficie limpia. Incline la columna de extracción para permitir sifón en el matraz a continuación. Desconecte el frasco y verter los residuos en un recipiente de desperdicio etiquetado solvente. Repetir los pasos 2.3 y 2,4 para los disolventes sucesivas de polaridad disminuyendo progresivamente, por ejemplo, cloroformo y hexano durante 12 h en cada caso. Permitir la muestra cutina tomate para secar el interior del dedal, ya sea por soplado de una corriente de gas nitrógeno sobre él o colocándolo en un horno de vacío a temperatura ambiente. Por último, medir la masa de la muestra seca y almacenar a temperatura ambiente en un frasco con tapa de rosca sellado con parafilm. 3. Aislamiento selectivo de ceras epicuticulares y Intracuticular 3,4 En primer lugar, lavar los tomates enteros (un lote por separado de los tomates de los descritos en 1.) Con agua destilada. Seque con paper y toallas Kimwipes, y el lugar que se derivan a la baja sobre un pedazo de papel de aluminio. Pinte los tomates enteros, con un 120% (w / w, la relación de masa) de las encías árabe solución acuosa de arriba hacia abajo de la moda y permitir que alrededor de una hora para la goma árabe que se seque sobre la piel de la fruta, dejando una capa delgada. Retire esta película con unas pinzas, teniendo cuidado de no perforar la piel de tomate. Repita el procedimiento una vez más. Añadir las películas a viales que contienen 1:1 (v / v) de cloroformo-agua y se mezcla durante tres minutos. Después de una agitación vigorosa y separación de fases, pipetear las fracciones de cloroformo y se evapora en viales separados cubierto, dejando cera epicuticular. Los tomates se mantendrán intactos físicamente. Sumergir ellos en cloroformo durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger la cera intracuticular después de evaporar el disolvente. Ahora, la cáscara de los tomates y tratarlos enzimáticamente (con celulasa y pectinasa en tampón acetato de sodio) para eliminar la celulosa y pectina, respectivamente (como se describe en <strong> 1). Si se desea, realizar desparafinado exhaustiva sobre estas cutículas enzimáticamente aislados por extracción Soxhlet (ver paso 2), utilizando tres disolventes de polaridad variable (metanol, cloroformo, y hexano, respectivamente). 4. Caracterización molecular de cutina del fruto de tomate por polarización cruzada de ángulo mágico de Spinning de estado sólido de Resonancia Magnética Nuclear (CPMAS ssNMR) 6 Lugar 4.6 mg de cutículas de tomate totalmente desparafinada (las entrada) en un 1,6 mm fastMAS zirconia del rotor utilizando el suministrado por el proveedor de herramientas de embalaje. (Cualquiera de las cutículas de tierra desparafinados tomate o piezas muy pequeñas de las cutículas parcialmente desparafinados son adecuados.) Asegúrese de que la muestra está llena de manera uniforme, pero no con demasiada fuerza, en el rotor. Después de poner en la tapa superior, pintar la mitad de la tapa con un rotulador negro de tinta para facilitar la medición de la velocidad de giro. Ajuste el número de calces del espectrómetro de RMN para el ancho mínimo de línea espectral a la mitad de la altura de unND calibrar el protón (1 H) y carbono (13 C) 90 ° anchuras de impulso utilizando un compuesto estándar tales como adamantano. Uso de glicina o la glutamina como compuestos modelo, obtener la máxima intensidad de la señal mediante la optimización de todos los parámetros (Hartmann-Hahn emparejan los niveles de potencia, 1 H-13 C tiempo de contacto, heteronuclear 1 H fuerza disociación) de la polarización cruzada de ángulo mágico-hilado (CPMAS) experimento. Para espectros adquiridos en una frecuencia de 1 H, de 600 MHz, las condiciones recomendadas incluyen 10 kHz o 15 kHz de frecuencia hilado, un retardo de 3-sec entre las adquisiciones, y el protón ESPINAL heteronucleares desacoplamiento 7 a una intensidad de campo magnético equivalente a una frecuencia de 185 kHz. Insertar el rotor cutina compacta en la sonda. Luego, coloque la sonda en el imán. Aumentar la velocidad de hilatura hasta 10 kHz gradualmente para comprobar si hay buena muestra de embalaje y la estabilidad del rotor. Verificar la estabilidad final hilatura del rotor dentro± 20 Hz. Ajustar la puesta a punto y hacer coincidir los condensadores de la sonda de forma iterativa para lograr la reflexión de potencia mínima, tanto en 1 H y 13 C RMN frecuencias. Ajuste la temperatura experimental a 25 ° C (o temperatura ambiente). Comienzo del experimento de pre-optimizado CPMAS correspondiente a la condición de Hartmann-Hahn coincidente determina en la frecuencia de 10 kHz hilatura. Adquirir los transitorios de 4096, la condición del espectro con la exponencial (Lorentz) línea de ampliación de 50 a 100 Hz, y hacer una transformada de Fourier para generar un espectro de RMN de la intensidad de la señal frente a productos químicos de protección (ppm). Referencia del producto químico C 13 turnos de forma externa mediante conjunto adamantano al 38,4 ppm (-CH 2 – grupo) 8 como estándar. Aumentar la frecuencia del rotor girando a 15 kHz y repetir la medición CPMAS (pasos 4,6-4,8) correspondiente a la condición de Hartmann-Hahn coincidente determinado a esta frecuencia último girando. Repeen los experimentos CPMAS (pasos 4.1-4.9) con muestras cutícula naturales (ceroso) y desparafinado parcialmente la fruta. 5. Sondeo de la superficie de la cutícula de tomate con Microscopía de Fuerza Atómica (Digital Instruments Nanoscope IIIa, los procedimientos pueden variar ligeramente entre microscopios) 6 Encienda el microscopio de sonda de barrido (SPM) (Fig. 2) y asegúrese de que el interruptor de modo de microscopio toggle se establece como la Microscopía de contacto Fuerza Atómica (AFM) de modo. Manual de levantar la cabeza SPM girando sus dos ajustables por el usuario mandos frontales. Separe la tipholder AFM de la cabeza del SPM, girando el tornillo de sujeción en la parte posterior de la cabeza. Use unas pinzas para quitar la existente cantilever de AFM de la tipholder, luego, con cuidado agarra una palanca de silicio nitruro de nuevo (Sonda de AFM) de su paquete e instalarlo en el lugar de la viga de edad. Utilice un microscopio de luz para comprobar que el recién instalado en voladizo AFM no está roto. Adjuntar ºde tomate e la cutícula de la muestra (una sección de la cutícula de tomate parcialmente desparafinados ~ 10 mm x 10 mm) en un disco de acero inoxidable (muestra puck) con cinta de doble cara. Utilizar un microscopio de luz para verificar que la superficie de la cutícula permanece plana y lisa después de la colocación de la muestra sobre el disco. Coloque el disco con la muestra cutícula tomate en la región magnético en la parte superior del escáner SPM. Ajuste los dos tornillos delanteros de ajuste manual del escáner de alta girando las perillas, establecer el tornillo posterior ajuste motorizado de aproximadamente el mismo nivel que los otros dos tornillos delanteros. Asegúrese de que los tres tornillos están lo suficientemente alto para evitar que se rompa la punta del AFM al colocar la tipholder en la cabeza del SPM. Vuelva a insertar el tipholder en la cabeza del SPM y fijarlo apretando el tornillo de sujeción en la parte posterior de la cabeza. Después de encender el láser, alinee el punto láser en el cantilever de AFM con la central (y) y derecha (x) perillas de ajuste del láser en la parte superior de la cabeza.Controlar el haz láser reflejado en un trozo de papel para colocar el punto láser exactamente en el extremo del voladizo AFM. Ajustar la posición del espejo móvil iterativamente utilizando los botones de ajuste fotodetector para lograr la máxima señal (señal SUM), asegurando así que el haz de láser reflejado se está recibiendo uniformemente por los cuatro cuadrantes del fotodetector. Bajo la punta del AFM por retracción de los tornillos de ajuste manual del frente y el tornillo posterior ajuste motorizado del escáner SPM, visualmente supervisar el enfoque de la punta del AFM hacia la superficie de la muestra con un microscopio invertido. Asegúrese de que los tres tornillos en el mismo nivel para evitar los artefactos de la imagen de una muestra inclinada. Llevar la punta hacia la muestra, pero no tan cerca que los toques de punta o se rompe a través de la superficie de la muestra. En este punto, la luz láser reflejada por el cantilever de AFM rebotará en el espejo móvil de la célula fotoeléctrica. Para el modo de contacto AFM con una siliconaCon nitruro de punta de AFM, establezca la señal de salida (desviación vertical) de tensión a -2 V para un punto de ajuste de 0 V y la señal de DIF (vertical / horizontal de diferencia) a 0 V mediante el ajuste de la posición del espejo. Usando el software de Nanoscope, haga clic en el icono de microscopio y seleccionar el perfil adecuado (modo de contacto AFM). Uso de la "Configuración de la exploración Controles" del panel, configurar la velocidad de barrido y, por ejemplo tamaño de escaneado, de 10 micras de tamaño de exploración y 2 Hz frecuencia de barrido. Permita que la punta del AFM para enganchar la superficie de la muestra haciendo clic en el icono de participar de punta. Al controlar el tornillo posterior motorizado de la base de SPM, el programa ahora bajará la punta hasta que se acopla a la superficie de la muestra. El proceso de exploración se iniciará automáticamente una vez que la punta ha participado con éxito. Supervisar el proceso de exploración utilizando ambos modos de imagen y el alcance del software, el ajuste de parámetros como consigna, ganancia integral, la ganancia proporcional, tamaño de escaneado, velocidad de exploración, las líneas y las muestras por línea iterativa para alcanzar el más altoimágenes de alta resolución. Inicie la exploración con un gran eje z rango (escala de datos); luego cuidadosamente reducir el valor de la escala de datos para observar el mejor contraste de características de la superficie sobre la imagen. Minimizar la aparición de zonas blancas en la imagen escaneada, los cuales indican que la altura de las características de la superficie superior a la disponible eje z rango. Para capturar la imagen para guardar el archivo de datos, y luego procesar los datos utilizando las funciones de aplanamiento para eliminar artefactos de la imagen debido al desplazamiento vertical del escáner (Z), los arcos de la imagen, y el desplazamiento vertical entre las líneas de exploración, 9, finalmente calcular la rugosidad media. Después de guardar los datos, retraer la punta del AFM mediante la inversión de la acción del motor del tornillo controlado por computadora que se utilizó para participar. El procesamiento de imágenes puede realizarse en modo fuera de línea de análisis de imagen y / o utilizar un equipo diferente. Utilice los mandos frontales inferiores grises de metal de la titular de la punta para cambiar las posiciones x e y de la zona de exploración, y luego repetir la operación en la muestra cinco ubicaciónciones para comprobar la reproducibilidad, en sustitución del cantilever de AFM, si la calidad de imagen se deteriora. 6. Los resultados representativos El análisis químico desplazamiento de la CPMAS 13 espectros RMN de C (Fig. 3) identificaron los principales grupos funcionales presentes en la cutícula tomate exhaustivamente desparafinado (cutina). Los restos de carbono clave en la biopolyester cutina resultaron ser alifáticos de cadena larga (0-45 ppm), alifáticos oxigenados (45-110 ppm), se multiplican unidos-y aromáticos (110-160 ppm), y carbonilos (160-220 ppm). Los restos alquilo oxigenados (CHO + CH 2 O) juegan un papel crucial en el establecimiento de conexiones covalentes entre las unidades monoméricas del biopolímero cutina, formando de este modo la arquitectura molecular de la matriz de cutina. Las diferencias en áreas de los picos relativos observados en la región espectral entre 45 ppm y 100 indican que la cutina mutante tiene una proporción relativamente grande de conformación structura reticulación CHO fracciones l en comparación con el tipo salvaje cutina, cuidadosas mediciones cuantitativas, mediante la polarización directa (DPMAS) RMN 5 métodos de apoyar esta inferencia (datos no mostrados). CPMAS 13 C espectros de RMN también mostró un pico de cera disminuyendo progresivamente a 31 ppm (fig. 4), lo que indica la eliminación secuencial de epi-y ceras intracuticular del compuesto cutina-cera mientras que conserva la arquitectura química principal del biopolímero cutina. Análisis paralelo imagen AFM (fig. 5) reveló irregularidades de la superficie debido a la extracción gradual de epi-y ceras intracuticular de la cutícula de fruta, lo que significa alteraciones en la organización del conjunto cuticular. . Figura 1 extractor Soxhlet (origen de la imagen: Wikipedia). "/> Figura 2. Un microscopio de barrido) de la sonda. B) SPM cabeza (adaptado del manual de capacitación AFM proporcionada por Digital Instruments). Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C espectros de RMN de manera exhaustiva desparafinados rojos cutículas maduras del fruto de tomate (las entrada) de tipo salvaje (M82) y mutante (CM15) muestran resonancias con los desplazamientos químicos correspondientes a los grupos funcionales de un ácido hydroxyfatty reticulado basado en poliéster y también algunos restos multiplican unidos. Todos los espectros fueron adquiridos con una frecuencia de 10 kHz girando. Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS espectros de RMN de los comerciales de tomate rojo maduro cutículas fruta exhiben cambios en la composición sobre la eliminación secuencial de las ceras y epicuticulares intracuticular por la goma de mecánica de extracción árabe y un two minutos de inmersión en el cloroformo, respectivamente. Todos los espectros fueron adquiridos con una frecuencia de 15 kHz girando. Figura 5. Imágenes AFM y estimaciones de rugosidad para el tomate parcialmente desparafinados comercial cutículas descrito en la Figura 4 después de la eliminación gradual de epicuticulares (izquierda) y intracuticular (derecha) las ceras.