Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

1. Enzymatische Isolierung von Tomato Schuppenschicht 5 Setzen Sie mehrere kommerzielle oder kultivierten Tomaten in eine Schüssel geben. Ziehen Sie die Haut von den Früchten in großen Teilen; entsorgen Sie den inneren Fruchtwand Gewebe. Waschen Sie die Tomaten-Skins mit VE-Wasser und bewahren sie unter Wasser in einem Becher. Herstellen einer 50 mM pH 4,0 Natriumacetatpuffer (bei ​​31 ° C), indem 1,22 g Natriumacetat-Trihydrat (M r. 136,08 g / mol) und 2,34 ml Eisessig (17,485 M) in einem Becherglas, Zugabe von 200 ml VE-Wasser, und dann den pH-Wert bis 4,0 bei 31 ° C Vorbereiten einer Mischung, die 4 ml Pektinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1 TCI America), 0,2 g Cellulase (EC 232.734.4; 1,3 Einheiten / mg Feststoff, Sigma Aldrich) und 13 mg NaN 3, und fügen Sie dann 196 ml Natriumacetat-Puffer auf die Enzym-Mischung zu 200 ml des fertigen Enzym-Cocktail zu erhalten. 5 vollständig einzutauchen den geschälten Tomaten Haut in der Enzym-Cocktail und inkubierenbei 31 ° C für 24 Stunden unter ständigem Schütteln (G24 Environmental Incubator Shaker, New Brunswick Scientific Co.). Sammeln Sie die Tomatenhäuten mit einem Küchensieb oder Büchner-Trichter und waschen Sie sie mit VE-Wasser. Danach legen Sie sie in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schützen wir die getrockneten Tomaten Skins in einer verschlossenen Flasche etikettiert und für die anschließende Entparaffinierung Verfahren. 2. Ausgiebige Entwachsen durch Soxhlet-Extraktion 6 Die Ausrüstung für die abschließende Entparaffinierung verwendet besteht aus einer Wärmequelle (Heizmantel und Variac Controller), Rundkolben für eine Lösungsmittel-Reservoir, Soxhlet, Sinter-oder Einweg-Glas Fingerhut Extraktionshülse, Antiprellvorrichtung Chips und einem Kondensator (siehe Abb. 1). Beachten Sie, dass der schmale Siphon Arm (Teile 6 und 7 in Abb. 1) sehr empfindlich und anfällig für Brüche ist, der vorsichtig behandelt werden. Setzen 0,5-1 g Tomate Haut (erhalten inSchritt 1.) in einem Mörser und mahlen die Probe zu einem groben Pulver mit einem Stößel, es sei denn die Proben für AFM-Messungen (Abschnitt 5) verwendet werden sollen. Füllen Sie ein Sinterglas-oder Einweg-Fingerhut etwa auf halber Strecke mit der Probe und mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig Platz an der Basis der Extraktionskolonne. Dann wird der Kühler und wickeln ihn in Alufolie. Erhitzen Methanol-Lösungsmittel (ACS-Qualität) in Gegenwart von einigen Antiprellsensor Chips bis zum Kochen unter Rückfluss gekocht und leicht an den Wänden des Kolbens. Decken Sie die Lösungsmittel-Reservoir sowohl mit Glaswolle und Alufolie. Überprüfen Sie den Prozess für eine Stunde, tritt Einstellung der Variac Spannung, so dass das Reservoir sammelt etwa einem Tropfen pro Sekunde und Absaugen im Soxhlet-Apparat, wenn der Fingerhut voll ist. Fahren Sie mit der Extraktion für 12 h, dann senken Sie den Heizmantel und lassen Sie das Gerät abkühlen. Entfernen der Haube und dem Reservoir als eine einzige Einheit, um das Lösungsmittel zu entsorgen. Verwenden Sie tweezeRS zu erhöhen Fingerhut bis knapp unter den Hals der Extraktionskolonne, abtropfen überschüssige Lösemittel aus, und platzieren Sie den Fingerhut auf einer sauberen Fläche. Kippen Sie die Extraktionskolonne zu ermöglichen Siphon in den Kolben unten. Ziehen Sie den Kolben und gießen Sie den Abfall in einen beschrifteten Abfallbehälter Lösungsmittel Behälter. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für aufeinanderfolgende Lösungsmittel von immer mehr abnahm Polarität, zB Chloroform und Hexan für 12 h in jedem Fall. Lassen Sie die Tomaten Cutin Probe im Inneren der Fingerhut, entweder durch Blasen eines Stickstoffgasstrom darüber oder indem man ihn in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur trocknen. Schließlich messen die Masse der trockenen Probe und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur in einem Schraubdeckel-Glas mit Parafilm verschlossen. 3. Selektive Isolierung von epikutikulären und Intracuticular Wachse 3,4 Zuerst waschen ganze Tomaten (eine separate Charge von Tomaten von den in 1 beschrieben.) Mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie sie mit papER Handtücher und Kimwipes und legen sie stammen nach unten auf ein Stück Alufolie. Malen Sie die ganze Tomaten mit 120% (w / w, Massenverhältnis) Gummiarabikum wässrigen Lösung in einer Top-Down-Mode und damit etwa eine Stunde für die Gummi Arabicum, um auf den Früchten die Haut trocknen, so dass ein dünner Film. Ziehen Sie diese Folie mit einer Pinzette vorsichtig ab, ohne Durchstechen der Haut Tomate. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Fügen Sie die Filme auf Fläschchen mit 1:1 (v / v) Chloroform-Wasser zugeben und 3 Minuten. Nach kräftigem Schütteln und Phasentrennung Pipette aus der Chloroform-Fraktionen und verdunsten sie in separaten Fläschchen aufgedeckt, so dass epikutikulären Wachs. Die Tomaten bleiben körperlich unversehrt. Man taucht sie in Chloroform für zwei Minuten bei Raumtemperatur und sammelt das intracuticular Wachs nach Verdampfen des Lösungsmittels. Nun, schälen Sie die Tomaten und behandeln sie enzymatisch (mit Cellulase und Pektinase in Natriumacetatpuffer) zu Cellulose und Pektin zu entfernen, bzw. (wie beschrieben in <strong> 1). Wenn gewünscht, führen erschöpfend Entparaffinierung auf diesen enzymatisch isolierte Kutikeln durch Soxhlet-Extraktion (siehe Schritt 2), mit drei Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität (Methanol, Chloroform, bzw. Hexan). 4. Molekulare Charakterisierung von Tomatenfrucht Cutin durch Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning Solid-State Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS Festkörper-NMR) 6 Platz 4-6 mg voll entwachste Tomate Nagelhaut (Zuschaltungen) in einem 1,6 mm Zirkonoxid fastMAS Rotor mit der vom Anbieter gelieferten Verpackung Werkzeug. (Entweder Boden entwachste Tomate Nagelhaut oder sehr kleine Stücke von teilweise entwachst Nagelhaut geeignet sind.) Stellen Sie sicher, dass die Probe gleichmäßig ist gepackt, aber nicht zu fest, im Rotor. Nach dem Anlegen der oberen Kappe, malen die Hälfte der Kappe mit einem schwarzen Filzstift-Tinten auf Messungen der Spin-Rate zu erleichtern. Passen Sie die Shim des NMR-Spektrometers für minimale spektrale Linienbreite auf halber Höhe einRunde Kalibrierung des Protons (1 H) und Kohlenstoff (13 C) 90 ° Impulsbreiten mit einem Standard-Verbindung, wie Adamantan. Mit Glycin oder Glutamin als Modell-Verbindungen, erhalten maximale Signalintensität durch die Optimierung aller Parameter (Hartmann-Hahn-Matching Leistungsstufen, 1 H – 13 C Kontaktzeit, heteronuklearen 1 H-Entkopplung Stärke) der Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) Experiment. Für Spektren bei einer 1 H-Frequenz von 600 MHz erworben empfohlenen Bedingungen sind 10 kHz oder 15 kHz dreht Frequenz, eine 3-Sekunden Verzögerung zwischen den Aufnahmen und SPINAL heteronuklearen Protonenentkopplung 7 bei einer magnetischen Feldstärke entspricht einer Frequenz von 185 kHz. Legen Sie die Cutin gepackten Rotor in die Sonde. Legen Sie dann die Sonde in den Magneten. Erhöhen Sie die Schleuderdrehzahl bis zu 10 kHz allmählich auf Probe für eine gute Verpackung und Rotor Stabilität zu überprüfen. Überprüfen Sie die Endspinnverfahren Stabilität des Rotors innerhalb± 20 Hz. Passen Sie den Tuning-und Matching-Kapazitäten der Sonde iterativ zu minimalen Leistung Reflexion sowohl 1 H und 13 C-NMR-Frequenzen zu erreichen. Stellen Sie den experimentellen Temperatur auf 25 ° C (oder Raumtemperatur). Starten Sie den voroptimierte CPMAS Experiment entsprechend der Hartmann-Hahn-Matching Zustand am 10 kHz Spinnen Frequenz bestimmt. Erwerben 4096 Transienten, Bedingung ist das Spektrum mit exponentiellen (Lorentz) Linienverbreiterung von 50-100 Hz, und führen Sie eine Fourier-Transformation, eine NMR-Spektrum von Signalintensität vs chemischen Abschirmung (ppm) zu generieren. Verweis der 13 C-chemischen Verschiebungen von außen mit Adamantan Satz bei 38,4 ppm (-CH 2 – Gruppe) 8 als Standard. Erhöhen der Rotorspinnmaschine Frequenz 15 kHz und wiederholen Sie die CPMAS (Schritte von 4,6 bis 4,8) entsprechend der Hartmann-Hahn-Anpassungsbedingung an diesem letzteren dreht Frequenz bestimmt. Repebei den Experimenten CPMAS (Schritte von 4,1 bis 4,9) mit natürlichen (wachsartige) und teilweise entwachste Obst Nagelhaut Proben. 5. Probing the Tomato Cuticle Oberfläche mit einem Rasterkraftmikroskop (Digital Instruments Nanoscope IIIa; Verfahren variiert leicht unter den Mikroskopen) 6 Schalten Sie den Rastersondenmikroskop (SPM) (Abb. 2) und stellen Sie sicher, dass das Mikroskop-Modus-Schalter, um den Kontakt Atomic Force Microscopy (AFM)-Modus eingestellt ist. Manuelles erhöhen SPM Kopf durch Drehen seiner zwei frei einstellbaren vorderen Knöpfe. Nehmen Sie das AFM tipholder aus dem SPM Kopf durch Drehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes. Verwenden Sie eine Pinzette, um die vorhandene AFM-Cantilever von der tipholder zu entfernen, dann schnappen Sie sich einen neuen sorgfältig Siliziumnitrid Cantilever (AFM) aus der Verpackung, und installieren Sie sie in die Stelle der alten Ausleger. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die neu installierte AFM-Cantilever nicht zerbrochen ist. Bringen the Tomaten Cuticula Probe (ein Abschnitt teilweise entwachst Tomaten Cuticula ~ 10 mm × 10 mm) auf eine Scheibe aus Edelstahl (Probe Puck) mit doppelseitigem Klebeband. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die Cuticula Oberfläche eben und glatt nach der Platzierung der Probe auf den Puck bleibt. Setzen Sie den Puck mit der Tomate Nagelhaut Probe auf die magnetische Region an der Spitze des SPM-Scanner. Stellen Sie die beiden vorderen Schrauben manuelle Einstellung des Scanners hohen indem Sie die Knöpfe, stellen Sie den Motor wieder Stellschraube auf etwa dem gleichen Niveau wie die anderen beiden vorderen Schrauben. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben gesetzt sind hoch genug, um nicht zu unterbrechen die AFM-Spitze beim Aufsetzen des tipholder in das SPM Kopf. Setzen Sie die tipholder in das SPM Kopf und befestigen Sie ihn durch Anziehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes. Nach dem Einschalten des Lasers, richten Sie den Laserpunkt auf der AFM-Cantilever über die zentrale (y) und rechts (x) Laser-Einstellknöpfe auf der Oberseite des Kopfes.Überwachen des reflektierten Laserstrahls auf ein Blatt Papier, um den Laserpunkt genau am Ende des Kraftsensors positionieren. Die Position des beweglichen Spiegels iterativ unter Verwendung der Photodetektor Einstellknöpfe auf den maximalen Signalpegel (SUM-Signal) zu erreichen, damit sichergestellt wird, dass der reflektierte Laserstrahl wird gleichmäßig durch die vier Quadranten der Photodetektor empfangen. Senken Sie die AFM-Spitze durch Zurückziehen der manuellen Einstellung vorderen Schrauben und den motorisierten zurück Stellschraube des SPM Scanner, optisch überwacht das Vorgehen der AFM-Spitze in Richtung der Probenoberfläche mit einem inversen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben auf dem gleichen Niveau sind, um Artefakte aus Abbildung eines gekippten Probe zu vermeiden. Bringen Sie die Spitze an die Probe, aber nicht so nahe, dass die Spitze berührt oder durchbricht der Probenoberfläche. An dieser Stelle reflektiert das Laserlicht aus der AFM-Cantilever wird abprallen den beweglichen Spiegel auf den Photodetektor. Für die Kontakt-AFM-Modus mit einem Silikoncon-Nitrid-AFM-Spitze, Stellen Sie das Ausgangssignal (Vertical Deflection) Spannung bis -2 V für eine 0 V Sollwert und der DIFF-Signal (vertikal / horizontal Unterschied) auf 0 V durch Einstellen der Position des Spiegels. Mit dem Nanoscope Software, auf dem Mikroskop-Symbol klicken und wählen Sie das entsprechende Profil (Kontakt Modus AFM). Mit der "Scan-Steuerungen-Einstellungen", stellen Sie die Abtastrate und die Scan-Format z. B. 10 Mikron Scan-Format und 2 Hz Abtastrate. Lassen Sie die AFM-Spitze zur Probenoberfläche durch Klicken auf die Spitze eingreifen-Symbol zu engagieren. Durch die Steuerung der motorisierten hintere Schraube der SPM-Basis, wird das Programm jetzt zu senken, bis sie die Spitze der Probenoberfläche einrastet. Der Scan-Vorgang beginnt automatisch, sobald die Spitze erfolgreich engagiert hat. Überwachen Sie den Scan-Vorgang mit den beiden Bild-Modi und Umfang der Software, Anpassung der Parameter wie Sollwert, integralen Verstärkung, Proportionalverstärkung, Scan-Format, Abtastrate, Linien und Muster / Linie iterativ, um die höchste zu erreichenauflösende Bilder. Starten Sie den Scanvorgang mit einem großen Sortiment z-Achse (Daten-Skala); dann vorsichtig reduzieren die Daten Skalenwert zu den besten Kontrast von Oberflächenstrukturen auf das Bild zu beobachten. Minimieren des Auftretens von weißen Bereichen in dem gescannten Bild, so dass die Höhe der Oberflächenmerkmale die verfügbare Z-Achse Bereich überschreitet anzuzeigen. Nehmen Sie das Bild, um die Daten-Datei zu speichern, dann bearbeiten Sie die Daten mit Abflachung Funktionen zur Bild-Artefakte aufgrund der vertikalen (Z)-Scanner Drift-, Bild-Bögen und vertikalen Versatz zwischen Scan-Linien zu entfernen; 9 Schließlich berechnen die durchschnittliche Rauheit. Nach dem Speichern der Daten, schieben Sie der AFM-Spitze durch die Umkehr der Wirkung des Computer-gesteuerten Motor Schraube, die verwendet werden, um ihm aufzunehmen. Die Bildverarbeitung kann im Offline-Modus Bildanalyse und / oder durchgeführt werden, über einen anderen Computer. Verwenden Sie die vorderen Unterseite grau Metall-Knöpfe des Düsenstock um die x-und y-Positionen der Scan-Bereich zu ändern, dann wiederholen Sie die Messung an fünf Standorten Probegen zu prüfen, Reproduzierbarkeit und ersetzt den AFM-Cantilever, wenn die Bildqualität verschlechtert. 6. Repräsentative Ergebnisse Chemische Verschiebung Analyse der CPMAS 13 C-NMR-Spektren (Abb. 3) identifiziert die wichtigsten funktionellen Gruppen in der erschöpfend entwachste Tomate Kutikula (Cutin). Die wichtigsten Kohlenstoff-Einheiten in der Cutin Biopolyester wurde festgestellt, dass langkettige Aliphaten (0-45 ppm), mit Sauerstoff angereichert Aliphaten (45 bis 110 ppm), mehrfach verklebt und Aromaten (110-160 ppm) und Carbonyle (160 bis 220 sein ppm). Die mit Sauerstoff angereicherten Alkylgruppen (CHO + CH 2 O) spielen eine wichtige Rolle bei der Festlegung kovalente Verbindungen zwischen den monomeren Einheiten der Cutin Biopolymer, wodurch die molekulare Architektur des Cutin Matrix. Unterschiede in der relativen Peak-Flächen im spektralen Bereich zwischen 45 und 100 ppm beobachtet nahe, dass die Mutante Cutin eine relativ große Menge der Querverbindung bildenden CHO structura hat l-Einheiten im Vergleich zu den Wildtyp-Cutin; sorgfältige quantitative Messungen durch direkte Polarisation (DPMAS) NMR-Methoden 5 unterstützen diese Folgerung (Daten nicht gezeigt). CPMAS 13 C-NMR-Spektren zeigten auch eine schrittweise abnehmenden Wachs-Peak bei 31 ppm (Abb. 4), welche die sequenzielle Entfernung von epi-und intracuticular Wachse aus der Cutin-Wachs-Verbund unter Beibehaltung der wichtigsten chemischen Architektur der Cutin Biopolymer. Parallel AFM-Bild-Analyse (Abb. 5) ergab, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche durch die schrittweise Gewinnung von epi-und intracuticular Wachse aus der Frucht Nagelhaut, was bedeutet, Veränderungen in der Organisation der Kutikula der Montage. . Abbildung 1 Soxhlet-Apparat (Bild Quelle: Wikipedia). "/> Abbildung 2. A) Rastersondenmikroskop. B) SPM Kopf (in Anlehnung an die AFM-Trainingshandbuch von Digital Instruments zur Verfügung gestellt). Abbildung 3. 150 MHz CPMAS 13 C-NMR-Spektren von erschöpfend entwachst roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut (Zuschaltungen) von Wildtyp-(M82) und Mutante (CM15) zeigen Resonanzen mit chemischen Verschiebungen entsprechend den funktionellen Gruppen eines vernetzten Hydroxyfettsäure Polyestermasse und auch einige mehrfach gebundenen Einheiten. Alle Spektren wurden mit einer 10 kHz-Frequenz Spinnen erworben. Abbildung 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-Spektren von kommerziellen roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut zeigen Veränderungen der Zusammensetzung auf sequenzielle Entfernung epikutikulären intracuticular und Wachse von Gummi Arabicum mechanische Extraktion und einer two-Minuten-Chloroform-Dip, beziehungsweise. Alle Spektren wurden mit einer 15 kHz-Frequenz Spinnen erworben. Abbildung 5. AFM-Aufnahmen und Rauheit Schätzungen für die teilweise entwachst kommerzielle Tomate Schuppenschicht in Abbildung 4 nach der stufenweise Abbau der epikutikulären (links) und intracuticular (rechts) Wachse beschrieben.