Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

1. Enzymatische Isolatie van Tomato nagelriemen 5 Plaats een aantal commerciële of gekweekte tomaten in een kom. Schil de huid van de vruchten in grote delen en schenk de binnenste vruchtwand weefsel. Was de tomaten skins met gedemineraliseerd water en het behoud van ze onder water in een beker. Bereid een 50 mM pH 4,0 natriumacetaatbuffer (bij 31 ° C) waardoor 1,22 g natriumacetaat trihydraat (M r. 136,08 g / mol) en 2,34 ml ijsazijn (17.485 M) in een bekerglas, toevoegen van 200 ml gedeïoniseerd water en de pH op 4,0 bij 31 ° C. Een mengsel met 4 ml pectinase (EC 3.2.1.15, 10 U ml -1 TCI Amerika), 0,2 g cellulase (EG 232.734.4; 1,3 eenheden / mg vast, Sigma Aldrich) en 13 mg NaN3, en voeg 196 ml natriumacetaat buffer om het enzym mengsel 200 ml van de uiteindelijke enzymcocktail verkrijgen. 5 volledig de gepelde tomaten huid in de enzymcocktail dompelen en incubeerbij 31 ° C gedurende 24 uur met constant schudden (G24 Environmental incubator Shaker New Brunswick Scientific Co.) Verzamel de tomaat huiden met behulp van een keuken zeef of Büchner trechter en hen met gedeïoniseerd water wassen. Daarna plaatst deze in een vacuümoven bij kamertemperatuur gedurende een uur. Bewaar de gedroogde tomaat vellen in een gemerkte en afgedekt fles voor de volgende ontdoen procedures. 2. Uitputtend was ontdoen door Soxhletextractie 6 De apparatuur die wordt gebruikt voor het volledig ontdoen bestaat uit een warmtebron (verwarming mantel en Variac controller), kolf met ronde bodem voor een oplosmiddel reservoir, Soxhletapparaat gesinterd glas vingerhoed of wegwerp extractiehuls, anti-stoten chips en een condensor (zie Fig. 1). Merk op dat de smalle sifon arm (delen 6 en 7 in figuur 1). Is zeer gevoelig en vatbaar voor breuk, die zorgvuldig gehanteerd. Doe 0,5-1 g van tomaat huid (verkregen instap 1.) in een vijzel, en maal het monster tot een grof poeder met een stamper, tenzij de monsters dienen te worden gebruikt voor het AFM-metingen (hoofdstuk 5). Vul een gesinterd glas of wegwerp vingerhoed ongeveer halverwege met het monster en gebruik maken van een pincet voorzichtig plaats deze aan de basis van de extractie kolom. Bevestig de condensor en wikkel het met aluminiumfolie. Verwarm de methanoloplosmiddel (ACS grade) in aanwezigheid van een paar kooksteentjes chips de kook zacht en refluxes op de wanden van de kolf. Bedek het oplosmiddel reservoir met zowel glaswol en aluminium folie. Controleer het proces voor een uur, komt voor het aanpassen van de Variac voltage, zodat het reservoir zich ophoopt ongeveer een druppel per seconde en overheveling binnen het soxhletapparaat wanneer de vingerhoed vol is. Ga door de extractie proces voor 12 uur, dan laat de verwarmingsmantel en laat het apparaat afkoelen. Verwijder de afzuigkap en het reservoir als een geheel te ontdoen van het oplosmiddel. Gebruik tweezers aan de vingerhoed tot net onder de hals van de extractiekolom te verhogen, afvoer overtollige oplosmiddel uit het, en plaats de huls op een schoon oppervlak. Kantel de extractiekolom te laten hevelen in de kolf hieronder. Koppel de kolf en giet het afval in een bestemde afvalbak oplosmiddel opvangbak. Herhaal stap 2.3 en 2.4 opeenvolgende oplosmiddelen geleidelijk afnemende polariteit, zoals chloroform en hexaan gedurende 12 uur in elk geval. Laat de tomaat cutine monster drogen in de huls, door blazen een stroom stikstofgas over het of door het in een vacuümoven bij kamertemperatuur. Tenslotte meten massa van de monster en het op kamertemperatuur in een afsluitbare pot afgesloten met parafilm. 3. Selectieve Isolatie van Epicuticular en Intracuticular Wassen 3,4 Was eerst hele tomaten (een afzonderlijke partij van tomaten van die beschreven in 1.) Met gedestilleerd water. Droog ze met papER handdoeken en Kimwipes, en leg ze het gevolg zijn naar beneden op een stuk aluminiumfolie. Verf de hele tomaten met 120% (w / w, massa-ratio) arabische gom waterige oplossing in een top-down mode en laat ongeveer een uur voor de Arabische gom om te drogen op de huid van het fruit, waardoor een dunne film. Verwijder deze film met een pincet, zorg dat u doorboren de tomaat huid. Herhaal de procedure nog een keer. Voeg de films flacons 1:1 (v / v) chloroform-water mengsel gedurende drie minuten. Na het krachtige agitatie en fasescheiding en pipetteer de chloroformfracties en verdampen ze in aparte ontdekt flacons, waardoor epicuticular was. De tomaten blijft fysiek intact. Dompel ze in chloroform twee minuten bij kamertemperatuur en verzamelen intracuticular was na afdampen van het oplosmiddel. Nu, schil de tomaten en enzymatisch te behandelen (met cellulase en pectinase in natriumacetaatbuffer) om cellulose en pectine respectievelijk te verwijderen (zoals beschreven in <strong> 1). Indien gewenst, voert u volledig van was ontdoen van deze enzymatisch geïsoleerde nagelriemen door Soxhletextractie (zie stap 2), met behulp van drie oplosmiddelen van verschillende polariteit (methanol, chloroform, en hexaan, respectievelijk). 4. Moleculaire karakterisering van Tomato Fruit cutine door Cross-polarisatie Magic-angle spinning Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS ssNMR) 6 Plaats 4-6 mg van volledig was ontdane tomaten nagelriemen (cutins) in een 1,6 mm fastMAS zirkonia rotor met behulp van de leverancier geleverde verpakking tool. (Ofwel de grond was ontdane tomaten nagelriemen of zeer kleine stukjes van gedeeltelijk was ontdaan nagelriemen zijn geschikt.) Zorg ervoor dat het monster gelijkmatig is verpakt, maar niet te strak, in de rotor. Na het opzetten van de dop, verf de helft van de kap met een zwart-inkt stift om metingen van de spin-tarief te vergemakkelijken. Pas de shimming van de NMR-spectrometer voor de minimale spectrale lijnbreedte op halve hoogte eennd kalibreren proton (1 H) en koolstof (13 C) 90 ° pulsbreedten een standaard samenstelling, zoals adamantaan. Met behulp van glycine of glutamine als model verbindingen, krijgen een maximale intensiteit van het signaal door het optimaliseren van alle parameters (Hartmann-Hahn matching vermogen, 1 H – 13 C contacttijd, heteronucleair 1 H ontkoppeling sterkte) van de cross-polarisatie magic-angle spinning (CPMAS) experiment. Voor spectra verkregen van een 1 H frequentie van 600 MHz, de aanbevolen omvatten 10 kHz tot 15 kHz spinnen frequentie 3-Sec tussen aankopen en HERNIAVERWIJDERING heteronucleair proton ontkoppeling 7 op een magnetische veldsterkte overeenkomt met een frequentie van 185 kHz. Plaats de cutine vol rotor in de cel. Plaats vervolgens de sonde in de magneet. Verhoog het spinnen snelheid tot 10 kHz geleidelijk aan om te controleren op een goede sample verpakking en rotor stabiliteit. Controleer de uiteindelijke draaiende stabiliteit van de rotor binnen± 20 Hz. Pas de tuning en bijpassende condensatoren van de sonde iteratief naar minimum vermogen reflectie te bereiken op zowel 1 H en 13 C NMR frequenties. Stel de experimentele temperatuur tot 25 ° C (of kamertemperatuur). Start de pre-geoptimaliseerde CPMAS experiment overeenkomt met het Hartmann-Hahn matching toestand vastgesteld op het 10 kHz draaien frequentie. Acquire 4096 transiënten, staat het spectrum met exponentiële (Lorentziaans) lijn verbreding van 50-100 Hz, en doe een Fourier-transformatie van een NMR-spectrum van de intensiteit van het signaal ten opzichte van chemische afscherming (ppm) te genereren. Referentie de 13 C chemische verschuivingen extern adamantaan ingesteld met op 38,4 ppm (-CH2 – groep) 8 als standaard. Verhoog de rotor draaien frequentie tot 15 kHz en herhaal de CPMAS meting (stappen 4,6-4,8) voor de Hartmann-Hahn matching voorwaarde bepaald op dit laatste spinning frequentie. Repeop de CPMAS experimenten (stappen 4.1 tot 4,9) met natuurlijke (wasachtige) en gedeeltelijk was ontdane vruchten cuticula monsters. 5. Onderzoek naar de Tomaat Cuticle Oppervlak met Atomic Force Microscopy (digitale instrumenten NanoScope IIIa; procedures zullen enigszins verschillen op de microscopen) 6 Zet de scanning probe microscoop (SPM) (fig. 2) en zorg ervoor dat de microscoop mode schakelaar is ingesteld op het contact Atomic Force Microscopy (AFM)-modus. Handmatig verhogen van de SPM hoofd door te draaien aan de twee door de gebruiker instelbare knoppen. Maak de AFM tipholder van de SPM hoofd door het draaien van de klemschroef aan de achterkant van het hoofd. Gebruik een pincet om de bestaande AFM cantilever te verwijderen uit de tipholder, dan voorzichtig pak een nieuwe siliciumnitride cantilever (AFM sonde) uit de verpakking en installeren in plaats van de oude cantilever. Gebruik een lichtmicroscoop te controleren of de nieuw geïnstalleerde AFM cantilever niet gebroken is. Bevestig ee tomaat cuticula monster (een deel van de gedeeltelijk was ontdane tomaten cuticula ~ 10 mm x 10 mm) op een roestvrij stalen schijf (sample puck) met dubbelzijdig tape. Gebruik een lichtmicroscoop te controleren of de cuticula oppervlak blijft vlak en glad na plaatsing van het monster op de puck. Plaats puck de tomaat opperhuid monster op de magnetische gebied op de top van de SPM scanner. Zet de voorste twee handmatige aanpassing schroeven van de scanner hoog door te draaien aan de knoppen, stel de gemotoriseerde terug stelschroef tot ongeveer hetzelfde niveau als de andere twee voorste schroeven. Zorg ervoor dat alle drie de schroeven zijn hoog genoeg is om te voorkomen dat het breken van de AFM tip bij het plaatsen van de tipholder in de SPM hoofd. Plaats de tipholder in de SPM hoofd en zet deze vast door de klemschroef aan de achterkant van het hoofd. Na inschakelen van de laser, lijn de laserspot op AFM uitkraging met de centrale (y) en rechts (x) laserinstelling knoppen op de bovenkant van de kop.Controleer de gereflecteerde laserstraal op een stuk papier de laserspot positioneren precies op het einde van de slede AFM. De positie van de beweegbare spiegel iteratief met de fotodetector verstelknoppen maximale signaal (SUM signaal) bereiken, waardoor de gereflecteerde laserstraal wordt gelijkmatig worden ontvangen door de vier kwadranten van de fotodetector. Laat de AFM tip door het terugtrekken van de handmatige aanpassing voorste schroeven en de gemotoriseerde rugverstelling schroef van de SPM scanner, visueel toezicht op de aanpak van de AFM tip in de richting van het monster oppervlak met een omgekeerde microscoop. Zorg ervoor dat alle drie de schroeven zijn op hetzelfde niveau te artefacten voorkomen dat beeldvorming een gekantelde monster. Breng de tip in de richting van het monster, maar niet zo dichtbij dat de punt raakt of doorbreekt het monster oppervlak. Op dit punt, de laser licht die door de AFM cantilever zal stuiteren de beweegbare spiegel om de fotodetector. Voor het contact AFM mode met een siliconecon nitride AFM tip, is het uitgangssignaal (verticale afbuiging) spanning tot en met -2 V voor een 0 V Setpoint en de DIFF Signaal (verticaal / horizontaal verschil) op 0 V door de positie van de spiegel. Met behulp van de NanoScope software, klik op de microscoop en selecteer het juiste profiel (Contact mode AFM). Met behulp van de "Scan Controls Settings" paneel, stelt u de scan snelheid en grootte van de scan bijvoorbeeld 10 micron grootte van de scan en 2 Hz scansnelheid. Laat de AFM tip om het monster oppervlak gaan door op de nemen-tip icoon. Door het controleren van de gemotoriseerde terug schroef van de SPM basis, zal het programma nu verlagen de punt totdat hij in de steekproef oppervlak. Het scanproces start automatisch zodra de tip heeft met succes ingeschakeld. Controleer het scanproces met behulp van zowel beeld en de omvang modi van de software, het aanpassen van parameters zoals setpoint, integrale versterking, proportionele versterking, grootte van de scan, scan rate, lijnen en monsters / lijn iteratief naar de hoogste te bereikenresolutie beelden. Start het scannen met een grote Z-as bereik (data-schaal), dan voorzichtig verlagen van de gegevens schaal waarde voor de beste contrast van oppervlakte-eigenschappen op de afbeelding te observeren. Minimaliseer het optreden van witte gebieden in het gescande beeld, waaruit blijkt dat de hoogte van het oppervlakte-eigenschappen van de beschikbare z-as bereik overschrijdt. Leg de afbeelding om het bestand op te slaan, dan verwerkt de gegevens met behulp van afvlakking functies om beeld artefacten als gevolg van verticale (Z)-scanner drift, beeld bogen, en de verticale offset tussen de scan-lijnen te verwijderen; 9 Ten slotte berekent de gemiddelde ruwheid. Na het opslaan van de gegevens, terug te trekken van de AFM tip door het omkeren van de werking van de computergestuurde schroef motor die werd gebruikt om het in te schakelen. Beeldverwerking kan worden uitgevoerd in de offline-modus beeldanalyse en / of met behulp van een andere computer. Gebruik de voorste onderste grijze metalen knoppen van de tip houder om de x-en y-posities van de te scannen gebied te wijzigen, dan wordt de meting herhaald op vijf locaties monstergen dat de reproduceerbaarheid te controleren, het vervangen van de AFM cantilever als de beeldkwaliteit achteruit gaat. 6. Representatieve resultaten Chemische analyse van de verschuiving CPMAS 13C NMR spectra (Fig. 3) die de grote functionele groepen in de limitatief ontparaffineerde tomaat opperhuid (cutine). De belangrijkste koolstof groepen in de cutine biopolyester bleken lange alifatische keten (0-45 ppm), zuurstof alifaten (45-110 ppm) meervoudig gebonden en aromaten (110-160 ppm), en carbonylen (160-220 ppm). De zuurstofrijke alkylresten (CHO + CH 2 O) spelen een cruciale rol bij het ​​vaststellen van covalente verbindingen tussen de monomere eenheden van de cutine biopolymeer, waardoor het vormen van de moleculaire architectuur van de gemiddelde inschakelduur matrix. Verschillen in relatieve piek gebieden waargenomen in het spectrale gebied tussen 45 en 100 ppm suggereren dat de mutant cutine een relatief groot deel van de cross-link vormen CHO structura heeft l groepen vergeleken met het wild-type cutine; voorzichtig kwantitatieve meting met behulp van directe polarisatie (DPMAS) NMR 5 methoden ondersteunen deze gevolgtrekking (gegevens niet getoond). CPMAS 13C NMR spectra werden ook door een geleidelijk afneemt was piek bij 31 ppm (Fig. 4) waarin de opeenvolgende verwijdering van epi-en intracuticular wassen van cutine wax composiet met behoud van de belangrijkste chemische structuur van de cutine biopolymeer. Parallel AFM beeldanalyse (afb. 5) is gebleken onregelmatigheden in het oppervlak als gevolg van de stapsgewijze extractie van epi-en intracuticular wassen van de vrucht nagelriem, betekenende veranderingen in de organisatie van de cuticulair montage. . Figuur 1 Soxhletapparaat (afbeelding bron: Wikipedia). "/> Figuur 2. A) Scanning Probe Microscope. B) SPM hoofd (overgenomen van de AFM training handleiding geleverd door Digital Instruments). Figuur 3. 150 MHz CPMAS 13 C NMR-spectra van exhaustief was ontdane rode rijpe tomaat fruit nagelriemen (cutins) van wild-type (M82) en mutant (CM15) resonanties te tonen met chemische verschuivingen die overeenkomt met de functionele groepen van een cross-linked hydroxyfatty zuur gebaseerde polyester en een aantal meervoudig gebonden groepen. Alle spectra werden opgenomen met een 10 kHz draaien frequentie. Figuur 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-spectra van commerciële rode rijpe tomaat fruit nagelriemen vertonen veranderingen in de samenstelling na sequentiële verwijdering van epicuticular en intracuticular was door de Arabische gom mechanische afzuiging en een two-minuten chloroform dip, respectievelijk. Alle spectra werden opgenomen met een 15 kHz draaien frequentie. Figuur 5. AFM beelden en ruwheid schattingen voor het gedeeltelijk ontwast commerciële tomaten opperhuid beschreven in Figuur 4 na de stapsgewijze verwijdering van epicuticular (links) en intracuticular (rechts) was.