空中的植物器官的保护角质层,超分子biopolyester蜡大会。我们提出的协议来监视选择性去除外延,从番茄果实角质层intracuticular蜡分子和微观尺度上由固态核磁共振和原子力显微镜,分别评估的工程表皮biopolyesters的交联的能力。
角质层,对陆生植物的地上部分疏水保护层,也作为一种多用途的各种生物和非生物胁迫的防御屏障功能和调节水流从外部环境。1一个biopolyester(角质)和长链不饱和脂肪酸(蜡)组成的角质层的主要结构框架;角质层功能的完整性取决于外epicuticular“层以及混合组成的角质生物高分子和'intracuticular'蜡2此处,我们描述了一个全面的协议。提取蜡详尽从商业番茄( 茄lycopersicum)的水果表皮或从顺序和选择性角质层复合epicuticular和intracuticular蜡的。耶特尔和Schaffer(2001)的方法,逐步从水果表皮萃取的epicuticular和intracuticular蜡被改编为3,4监察过程顺序蜡去除,固态交叉极化魔角旋转(CPMAS)13核磁共振光谱在原子力显微镜(AFM)的同时,提供补充信息的散装材料的分子水平的结构型材微尺度地形和表皮表面粗糙度。栽培的野生型和单基因突变体番茄果实脱蜡角质层,以评估交联的能力,金管局13 C核磁共振被用来比较含氧脂肪(CHO和CH 2 O)的化学基团的相对比例。
逐步索氏提取不同极性溶剂小组力竭的脱蜡提供一个有效的手段来孤立根据他们的脂肪族和芳香族成分的疏水特性的蜡基,而维护角质biopolyester的化学结构。机械提取epicuticular蜡和塞莱景象intracuticular蜡去除时,由互补的物理方法监测,提供了前所未有的手段来调查角质层大会:这种方法揭示蜡各类超分子组织结构整合,角质蜡矩阵的架构,和化学每个组成成分。此外,固态13 C-NMR揭示了野生型和突变型的红色成熟的番茄果实在CHO和CH 2的化学基团的相对数的差异。核磁共振技术指纹不溶物,无定形,化学异构的表皮材料的分子结构提供了特殊的工具。作为一种非侵入性的表面选择性成像技术,原子力显微镜furnishes有效和直接的手段来探测纳米微米尺度上的表皮大会的组织结构。
协议此处所述允许无破坏性的化学分解需要一个复杂棘手的植物材料的分子和微观的详细表征。调查各种脂类(蜡),控制的表皮大会的组织结构,我们进行和监督程序,选择性epicuticular和intracuticular蜡去除表皮的异构混合勾兑的角质biopolyester的。固态13 C核磁共振被用来衡量的蜡分子成分的提取,并担任原子力显微镜来检查表面粗糙度随之变化。6,11栽培野生型和单基因比较交联能力的cutins突变体番茄果实,固态13 C-NMR也被用来估计CHO和CH 2的化学基团的相对数。
一些设计特点此协议是显着的。由于蜡的材料涵盖范围广,治疗血脂水果表皮与一系列具有不同极性的溶剂实现详尽脱蜡至关重要。此外,脱蜡时间可以有所不同,从8小时到24小时,这取决于角质层样品的性质。一贯提取的完好的水果表皮epicuticular蜡,它是要申请的表面涂胶均匀。
固态CPMAS 13 C-NMR 12是一种快速识别各种高度异质性和不溶性的植物生物大分子的结构部件,同时保留其原生的物理特性的定性方法; 13传统的解决方案核磁共振也可以用于特征提取的蜡混合物。如果所需的完整植物聚合物,5高保真直接的极化魔角旋转(四官能团的定量估计PMAS)13核磁共振5,14应作为一种辅助方法使用。功能组别的准确定量需要仔细优化循环时间,激发脉冲长度,异脱钩的实力,可以设置使用的TPPM 16或1 H场强度范围从50千赫至185千赫15异脱钩脊髓7的方法。除了 这些参数,CPMAS测量的灵敏度依赖于自旋锁的时间和哈特曼-哈恩匹配条件。15传统CPMAS地方,一个倾斜幅度CP(斜坡CP)技术可以实现最大限度的跨极化不同的1 H振幅线性(约20-50%)或切线,同时保持13 C场强度常数在自旋锁期间(或反之亦然)的振幅17,18开展CPMAS测量效率。至少两个不同的ROTOR-纺纱频率是势在必行,以区别于主要谱峰旋转边带。
并发AFM接触模式进行测量,使角质层的表面状况与高扫描速度和分辨率高,例如19在连续去除蜡质成分直接成像。在攻丝的操作在任何情况下原子力显微镜(非接触式)的模式可以被用来作为一个微妙的“软”的植物材料的表面特性的替代品,避免可能造成的损害向横向(剪切)部队和样品表面刮。5,20 ,连续采集多个图像表面上的相同点服务,以确定任何表面损伤,由于在AFM测量的探头表面的相互作用“。为了获得最佳的重复性6,21,弹簧常数适用于软表皮表面的原子力显微镜探针应该使用,温度和湿度的恒定6,15,20应予维持。 </s鉴于固态核磁共振>提供了一个分子轮廓综平均(散装)在番茄果实表皮的性质,原子力成像提供了这些精美复杂的大分子组件的表面地形跟踪互补的无创探头22,23。1,2
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国家科学基金会资助#断路器-0741914和MCB-0843627;由国家卫生研究院G12的国家研究资源中心RR03060-26在纽约市学院提供额外的基建支援。我们非常感谢JKC玫瑰在康奈尔大学植物生物学系组为M82的(野生型)和CM15(突变)番茄角质层。我们感谢他慷慨的帮助与原子力显微镜实验的纽约城市学院化学教授亚历山大Couzis的工程组博士斯皮罗斯Monastiriotis。我们感谢支持图形设计小姐劳伦Gohara。
Name of the reagent | Company | Catalog no. | コメント |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
Variac Controller | |||
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
Glass wool | VWR | RK20789 | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
Tweezers | VWR | 82027-452 | |
Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
Nitrogen gas | |||
Parafilm | VWR | 52858 | |
Paper towels | VWR | 89002-984 | |
Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
Gum arabic | Sigma | G9752 | |
1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
Light microscope | Digital Instruments | ||
Magnetic puck | Digital Instruments | ||
Double sided tape | VWR | ||
Fruit Peeler | |||
Büchner funnel | VWR | 89038 |