Spectral imagerie confocale de fluorescence tels taggés récepteurs nicotiniques dans souris knock-in avec l'administration chronique de nicotine

Canaux ioniques ligand-dépendants dans le système nerveux central (SNC) sont impliqués dans de nombreuses conditions qui ont de graves conséquences médicales et sociales. Par exemple, la dépendance à la nicotine par le biais du tabagisme est une cause majeure de décès prématuré (Organisation mondiale de la Santé) dans le monde entier et est probablement causée par une altération de l'ion canal de distribution dans le cerveau ^1. L'exposition chronique à la nicotine chez les rongeurs et les humains dans les résultats une augmentation du nombre de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) dans le tissu cérébral ^1-3. De même, des altérations dans les GluN1 ou GluA1 glutamatergiques canaux ont été impliqués dans le déclenchement de la sensibilisation à d'autres drogues addictives comme la cocaïne, les amphétamines et les opiacés ^4-6.

Par conséquent, la capacité de cartographier et de quantifier les schémas de distribution et d'expression des canaux ioniques spécifiques revêt une importance cruciale pour comprendre les mécanismes de dépendance. L'étude du cerveau spécifique à la région effets de médicaments individuels a été avancé par l'avènement des techniques tels que des ligands radioactifs. Cependant, la faible résolution spatiale de la liaison ligand radioactif empêche la capacité à quantifier les canaux ioniques ligand-dépendants dans les sous-types spécifiques de neurones.

Génétiquement codés journalistes fluorescents, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses nombreuses variantes de couleurs, ont révolutionné le domaine de la biologie ^7. Par marquage génétiquement un journaliste fluorescent pour une protéine endogène, on peut visualiser les protéines in vivo ^7-10. Un avantage de marquage des protéines par fluorescence avec une sonde est l'élimination de l'utilisation d'anticorps, qui ont des problèmes de non-spécificité et de l'accessibilité à la protéine cible. Nous avons utilisé cette stratégie pour nAChR étiquette fluorescente, qui ont permis l'étude de l'assemblage des récepteurs à l'aide de transfert Förster Resonance Energy (FRET) dans des cellules transfectées en culture ^11. Plus récemment, nous avons utilisé le knock-dans l'approche de souris ingénieur avec une protéine fluorescente jaune marqué a4 nAChR sous-unités (α4YFP), permettant la quantification précise de l'ex vivo des récepteurs à la résolution submicronique dans les neurones du système nerveux central via la microscopie confocale spectrale ^12. Le ciblée fluorescente knock-in mutation est incorporée dans le locus endogène et sous le contrôle de son promoteur natif, produisant des niveaux normaux d'expression et la régulation du récepteur par rapport aux récepteurs non marqués dans les souris de type sauvage. Cette approche knock-in peut être étendue à fluorescence marquer d'autres canaux ioniques et offre une approche puissante de visualiser et de quantifier les récepteurs dans le SNC.

Dans cet article, nous décrivons une méthodologie pour quantifier les changements dans l'expression nAChR dans les neurones du système nerveux central spécifiques après l'exposition à la nicotine chronique. Nos méthodes comprennent l'implantation de la pompe mini-osmotique, fixation par perfusion intracardiaque, l'imagerie et l'analyse des rec nicotinique marquées par fluorescencesous-unités de eptor α4YFP souris knock-in (Fig. 1). Nous avons optimisé la technique de fixation afin de minimiser l'autofluorescence de tissue.We cerveau fixé décrire en détail notre méthodologie d'imagerie utilisant un microscope confocal spectral en conjonction avec un algorithme de déconvolution spectrale linéaire pour soustraire du signal autofluoresent afin d'obtenir avec précision α4YFP signal de fluorescence. Enfin, nous montrons des résultats de chronique induite par la nicotine régulation positive des récepteurs α4YFP dans la voie perforante médiane de l'hippocampe.